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«Establishment of cellular test systems for the identification of novel inhibitors of the HIV-1 Vif-induced APOBEC3G-degradation Dissertation zur ...»

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Etablierung von zellulären Testsystemen für die Identifizierung von

neuartigen Inhibitoren des HIV-1 Vif-induzierten APOBEC3G-Abbaus

Establishment of cellular test systems for the identification of novel

inhibitors of the HIV-1 Vif-induced APOBEC3G-degradation

Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades

der Graduate School of Life Sciences,

Julius-Maximilians-Universität Würzburg

Klasse: Infection and Immunity

vorgelegt von

Boris Nowotny

aus Prüm

Würzburg 2012

Eingereicht am:

Mitglieder des Promotionskomitees:

Vorsitzender: Prof. Dr. Thomas Hünig

1. Betreuer: Prof. Dr. Axel Rethwilm

2. Betreuer: Dr. Gabriele Pradel

3. Betreuer: Prof. Dr. Kelly Chibale

4. Betreuer: Prof. Dr. Tanja Schirmeister

Tag des Promotionskolloquiums:

Doktorurkunde ausgehändigt am:

Affidavit I hereby confirm that my thesis entitled “Establishment of cellular test systems for the identification of novel inhibitors of the HIV-1 Vif-induced APOBEC3G- degradation” is the result of my own work. I did not receive any help or support from commercial consultants. All sources and / or materials applied are listed and specified in the thesis.

Furthermore, I confirm that this thesis has not yet been submitted as part of another examination process neither in identical nor in similar form.

Place, Date Signature Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich an Eides statt, die Dissertation „Etablierung von zellulären Testsystemen für die Identifizierung von neuartigen Inhibitoren des HIV-1 Vifinduzierten APOBEC3G-Abbaus“ eigenständig, d.h. insbesondere selbständig und ohne Hilfe eines kommerziellen Promotionsberaters, angefertigt und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet zu haben.

Ich erkläre außerdem, dass die Dissertation weder in gleicher noch in ähnlicher Form bereits in einem anderen Prüfungsverfahren vorgelegen hat.

Ort, Datum Unterschrift

INHALTSVERZEICHNIS

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

1.1. HIV und AIDS

1.2. Das HI-Virus

1.2.1. Allgemeines

1.2.2. Virusaufbau und Replikation

1.2.3. Antivirale Therapie

1.3. Wirtsfaktoren und HIV-1

1.4. Die APOBEC-Proteinfamilie

1.5. APOBEC3-Cytidindeaminase

1.5.1. Restriktion von HIV-1 durch APOBEC3G

1.5.2. Neutralisierung der antiviralen Aktivität von A3G durch Vif

1.5.3. Vif vermittelte proteasomale Degradation von A3G

1.5.4. Weitere von der A3G Restriktion unabhängige Funktionen von Vif...............19 1.5.5. Die Vif vermittelte A3G Neutralisation als Ziel für antivirale Wirkstoffe.......19

1.6. Identifizierung von Proteinabbauinhibitoren

1.7. Zielsetzung der Arbeit

2. Material

2.1. Relevante Gerätschaften

2.2. Chemikalien

2.3. Antikörper

2.4. Nukleinsäuren

2.4.1. Synthetische Oligonukleotide

2.4.2. Plasmide

2.5. Zellen

2.5.1. Prokaryontische Zellen

2.5.2. Eukaryontische Zellen

2.6. Enzyme

2.7. Antibiotika-Stammlösungen

2.8. DNA- und Proteingrößenstandards

2.9. Kits

I

INHALTSVERZEICHNIS

2.10. Puffer, Lösungen und Nährmedien

2.11. Programme zur Datenauswertung

2.12. Sonstige Materialien

3. Methoden

3.1. Molekularbiologische Methoden

3.1.1. DNA-Amplifikation mittels PCR

3.1.2. Kolonie-PCR

3.1.3. Mutagenese-PCR

3.1.4. DNA-Sequenzierung

3.1.5. Hybridisierung von Oligonukleotiden

3.1.6. Gelelektophoretische Auftrennung von DNA

3.1.7. Isolierung von DNA aus Agarosegelen

3.1.8. Restriktion von DNA

3.1.9. DNA-Dephosphorylierung

3.1.10. Ligation von DNA-Fragmenten

3.1.11. Herstellung chemisch-kompetenter E. coli-Zellen

3.1.12. DNA-Transformation

3.1.13. Isolierung von Plasmid-DNA im Mini-Maßstab (Mini-Prep)

3.1.14. Isolierung von Plasmid-DNA im Maxi-Maßstab (Maxi-Prep)

3.1.15. Photometrische DNA-Bestimmung

3.1.16. Kryokonservierung von E. coli-Zellen

3.1.17. Ethanolpräzipitation von Plasmid-DNA

3.1.18. Isolierung von genomischer DNA aus Mammalierzellen

3.2. Zellbiologische Methoden

3.2.1. Kultivierung adhärenter Mammalierzellen

3.2.2. Kultivierung der stabilen Zelllinien

3.2.3. Langzeitlagerung von Mammalierzellen

3.2.4. Fixierung von Zellen für die Mikroskopie

3.2.5. Durchflusszytometrie (FACS-Analyse)

3.2.6. Transiente Transfektion

3.2.7. BiFC-Assay im 96-Well Format

3.2.8. Herstellung der 293TVif TetOff/EYFP-A3G-Zelllinie

3.2.9. Herstellung der HeLaDsREDmonomer TetOff-Zelllinie

II

INHALTSVERZEICHNIS

3.2.10. MTT-Assay

3.2.11. Substanzscreening

3.2.12. Substanzscreening im 96-Well Format

3.2.13. Arbeiten mit dem Multifluoreszenz-Assay

3.3. Virologische Methoden

3.3.1. Herstellung VSV-G pseudotypisierter retroviraler Vektoren





3.3.2. Herstellung viraler Partikel mit dem Drei-Plasmid-System

3.3.3. Aufkonzentrierung von Viruspartikeln mittels Ultrazentrifugation..................55 3.3.4. Virustiterbestimmung

3.3.5. Test zum Nachweis der antiviralen Aktivität von A3G

3.4. Proteinbiochemische Methoden

3.4.1. Zelllyse

3.4.2. Bestimmung der Proteinkonzentration

3.4.3. SDS-Polyacrylamidgelektrophorese (PAGE)

3.4.4. Western-Blot

4. Ergebnisse

4.1. Etablierung der 293TVif TetOff/EYFP-A3G-Zellinie als A3G-Abbauassay

4.1.1. Darstellung der Expressionskonstrukte

4.1.2. Funktionalitätskontrolle der Expressionskonstrukte

4.1.2.1. Charakterisierung des EYFP-A3G Konstrukts

4.1.2.2. Charakterisierung des TetOff-Vif-Expressionssystems

4.1.3. Generierung und Charakterisierung der 293TVif TetOff/EYFP-A3G-Zelllinie...........68 4.1.3.1. Analysen zur Kinetik des EYFP-A3G Abbaus

4.1.3.2. Untersuchungen zum Proteasom vermittelten EYFP-A3G Abbau unter Verwendung spezifischer Inhibitoren des Proteasomsystems

4.1.3.3. Evaluierung der 293TVifTetOff/EYFP-A3G-Zelllinie für die Substanzsuche im 96-Well Format

4.2. Entwicklung von Testsystemen zum Ausschluss falsch positiv wirkender Substanzen

4.2.1. Generierung und Charakterisierung der HeLaDsREDmonomerTetOff -Zelllinie..........77 4.2.2. Etablierung der 293TODD-SBFP2 -Zelllinie als Proteasomkontrollassay..............79

4.3. Etablierung eines multifluoreszenten Screening-Assays

4.4. Etablierung eines auf der BiFC-Technik basierenden Testsystems zur quantitativen Analyse der Vif-ElonginC-Interaktion

III

INHALTSVERZEICHNIS

4.4.1. Bestimmung der Spezifität des BiFC-Assay

4.4.2. Weitergehende Charakterisierung der Vif BiFC-Konstrukte

4.5. Substanzscreening

4.5.1. Analyse von RN-18 Derivaten

4.5.2. RN-18 hemmt die TetOff-regulierte Genexpression

4.5.3. RN-18 wirkt cytotoxisch

4.5.4. Analyse von RN-18 mit dem Multifluoreszenz-Assay

4.5.5. Analyse von niedermolekularen Vif-ElonginC-Interaktionsinhibitoren...........98

5. Diskussion

5.1. Etablierung einer A3G/Vif doppelstabilen Zelllinien als Testsystem für die Identifizierung von neuartigen A3G-Abbauinhibitoren

5.2. Etablierung von Kontrollassays zur Detektion falsch positiv wirkender Substanzen

5.3. Etablierung eines auf der BiFC-Technik basierenden Systems zur Identifizierung von Inhibitoren der Vif-ElonginC-Interaktion

5.4. Analyse von RN-18 Derivaten

5.5. Analyse von Inhibitoren der Vif- ElonginC-Interaktion

5.6. Schlussbemerkung und Ausblick

6. Zusammenfassung

7. Summary

8. Literatur

9. Abkürzungen

10. Veröffentlichungen

11. Danksagung

12. Anhang

12.1. Analyseergebnisse der Vif-ElonginC-Interaktionsinhibitoren

12.2. DNA-Sequenzen

12.3. Lebenslauf

–  –  –

Den letzten Schätzungen zufolge waren Ende 2010 etwa 34 Millionen Menschen weltweit mit dem HI-Virus infiziert (UNAIDS, 2011). Dies war eine Steigerung der Infizierten um 17% gegenüber der im Jahr 2009 publizierten Zahl. Im Gegensatz dazu kann sowohl bei der Zahl der Neuinfektion als auch bei den AIDS bedingten Todesfällen ein stetiger Rückgang verzeichnet werden. So sank die Zahl von Neuinfektionen von 3,2 Millionen im Jahr 2001 auf 2,7 Millionen Ende 2010. Die Rate der AIDS bedingten Todesfälle betrug 1,8 Millionen, was einer Reduktion von 20% gegenüber dem Jahr 2005 entspricht. Trotz des positiven Trends, der bei Neuinfektionen als auch bei der Todesrate zu verzeichnen ist, stellt HIV weiterhin eine große gesellschaftliche Bedrohung dar, gerade für Schwellen- und Entwicklungsländer in Subsahara-Afrika.

Erste Hinweise auf das erworbene Immundefizienzsyndrom (AIDS) gab ein CDCBericht aus dem Jahr 1981 (Pneumocystis pneumonia-Los Angeles. MMWR. Morbidity and mortality weekly report 1981 30, 250-252). In diesem wurde von fünf jungen Männern berichtet, die an einer durch Pneumocystis jirovecii verursachten Pneumocystispneumonie (PCP) litten, einer Erkrankung die in der Regel nur in Verbindung mit einem supprimierten Immunsystem auftritt.

Einige Zeit nach den ersten dokumentierten AIDS Fällen konnte mit dem humanen Immundefizienzvirus vom Typ 1 (HIV-1), anfänglich als humanes T-lymphotropes Virus 3 (HTLV-3) oder lymphadenopathy-assoziertes Virus (LAV) bezeichnet, und dem Immundefizienzvirus vom Typ 2 (HIV-2), vormals LAVII, die ursächlichen Erreger für die Immunschwächekrankheit identifiziert werden (Barré-Sinoussi et al., 1983; Gallo et al., 1983;

Popovic et al., 1983; Clavel et al., 1986).

Der hauptsächliche Übertragungsweg für das HI-Virus in der westlichen Welt ist heutzutage der ungeschützte Geschlechtsverkehr. Eine Transmission des HI-Virus durch intravenösen Drogenkonsum oder durch eine Mutter-zu-Kind Übertragung ist von nachrangiger Bedeutung (Forsman und Weiss, 2008).

Eine HIV-Infektion wird allgemein in drei Phasen unterteilt: Die akute Phase, die chronische Phase und AIDS (Flint et al., 2009). Die akute Phase schließt unmittelbar an die primäre Infektion an und erstreckt sich über einen Zeitraum von 4-8 Wochen. In den ersten zwei Woche nach der HIV-Exposition treten häufig Schwellungen der Lymphknoten

EINLEITUNG

(Lymphadenopathy) oder Grippe-ähnliche Erkrankungen auf. Innerhalb der ersten Hälfte der akuten Phase kommt es zu einem massiven Anstieg der Viruslast, die einen Maximalwert von 1x107 viralen RNA Kopien pro mL Plasma erreichen kann, um dann in der zweiten Hälfte wieder stark abzunehmen (Sierra et al., 2004). Im gleichen Zeitraum ist eine deutliche Reduktion an zirkulierenden CD4 positiven T-Zellen zu verzeichnen, deren Zahl gegen Ende der akuten Phase wieder ansteigt, dabei allerdings nur selten wieder den Ausgangswert von ca.

1000 Zellen/µL erreicht (Flint et al. 2009).

Auf die akute Phase folgt eine chronische bzw. asymptomatische Phase. Diese ist hauptsächlich durch ein langsames, aber stetes Absinken der Konzentration an zirkulierenden CD4 positiven T-Zell bei gleichbleibender Viruslast im Blut charakterisiert. Die Höhe der Viruslast (viraler Setpoint) zu Beginn dieser Phase lässt eine Vorhersage über die Progression der HIV-Infektion zu (Langford et al., 2007). Generell gilt, je höher der virale Setpoint desto schneller entwickelt sich eine HIV-Infektion zum Krankheitsbild AIDS. Das Ende der chronischen Phase und der Beginn des Krankheitsbildes AIDS ist durch ein Abfallen der Konzentration an CD4 positiven T-Zell unter einen Wert von 200 Zellen/µL und einem gleichzeitig starken Anstieg der Viruslast gekennzeichnet (Forsman und Weiss, 2008; Flint et al., 2009). Klinisch ist AIDS im Wesentlichen durch das Auftreten von opportunistischen Infektionen der Haut, der Lunge, des Gastrointestinaltraktes sowie der Entstehung von Tumoren, wie beispielsweise dem Kaposi-Sarkom und malignen Lymphome gekennzeichnet.



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