WWW.BOOK.DISLIB.INFO
FREE ELECTRONIC LIBRARY - Books, dissertations, abstract
 
<< HOME
CONTACTS



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 25 |

«Strukturelle Untersuchungen der Konformationsänderungen im proapoptotischen Protein Bax und der räumlichen Anordnung des membranständigen ...»

-- [ Page 1 ] --

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Chemie und

Pharmazie der Ludwig Maximilians Universität München

Strukturelle Untersuchungen der Konformationsänderungen

im proapoptotischen Protein Bax und der räumlichen

Anordnung des membranständigen Baxoligomers

Stephanie Wiebke Bleicken

aus Buchholz in der Nordheide

Erklärung:

Diese Dissertation wurde im Sinne von §13 Abs. 3 der Promotionsordnung vom

29 Januar 1998 von Prof. Oesterhelt betreut.

Ehrenwörtliche Versicherung:

Diese Dissertation wurde selbstständig ung ohne unerlaubte Hilfe erarbeitet.

München am 12.05.08 Stephanie Bleicken Dissertation eingereicht am 15.05.08

1. Gutachter Prof. Oesterhelt

2. Gutachter Prof. Steinhoff Mündliche Prüfung am 17.09.08 Für Jan Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung: 6 Kapitel 1: Einleitung 9 Apoptose, Autophagie, Nekrose – Zelltod in Metazoen 9 Apoptotische Signalkaskaden 11 Die Initiation der Mitochondrien-vermittelten (intrinsischen) Apoptose 13 Stresserkennung im Cytosol und Signalweitergabe zum Mitochondrium mittels der Bcl-2 Proteine 14 Lageveränderung von proapoptotischen Faktoren aus dem Mitochondrium ins Cytosol 16 Die Struktur der Bcl-2 Proteine 19 Das proapoptotische Protein Bax 20 Das proapoptotische Protein Bak 22 Ziele 23 Ergebnisse und Diskussion 24 Kapitel 2: Proteinexpression und Reinigung von Bax 24 Ziel 24 Expression und Reinigung des Bax Wildtypproteins 24 Expression und Reinigung von Expression Baxmutanten 27 Qualitäts- und Reinheitskontrolle von Bax WT und der Mutanten 27 Vorstellung der untersuchten Konformationen von Bax 28 Herstellung von oligomeren Bax in Detergenz 29 Herstellung von membranständigem Bax

–  –  –

Zusammenfassung:

In mehrzelligen Organismen müssen Veränderungen in der Zellzahl - durch Zellteilung oder Zelltod - strikt reguliert werden, da Störungen zu lebensgefährlichen Krankheiten wie Krebs, neurodegenerativen oder Autoimmunerkrankungen führen können. Eine Schlüsselrolle in der Kontrolle des Zelltods übernehmen die Bcl-2 Proteine, die sich in drei Untergruppen unterschiedlicher Funktion unterteilen lassen: (1) antiapoptotische Bcl-2 Proteine, (2) proapoptotische BH3-only Bcl-2 Proteine und (3) proapoptotische multidomain Bcl-2 Proteine. Während das funktionelle Spektrum der Bcl-2 Proteine ständig erweitert wird, ist das Wissen über ihre strukturellen Eigenschaften immer noch begrenzt.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Struktur des proapoptotischen multidomain Bcl-2 Proteins Bax, das die Mitochondrien-vermittelte Apoptose einleiten kann. Bax kann vom BH3-only Bcl-2 Protein tBid und anderen Faktoren aktiviert oder von den antiapoptotischen Bcl-2 Proteinen inaktiviert werden. Wenn Bax aktiviert wurde (a) entlässt es Cytochrom c aus den Mitochondrien ins Cytosol, und es beeinflusst sowohl (b) die Mitochondrienmorphologie als auch (c) die Ca2+-Homöostase der Zelle. Die Aktivität des Proteins ist mit seiner räumlichen Struktur verknüpft. In vivo sind zwei Konformationen bekannt: (1) Eine inaktive, lösliche und monomere Konformation, die im Cytosol von gesunden Säugerzellen vorkommt und (2) eine aktive, membranständige und oligomere Konformation, die in die äußere Mitochondrienmembran von apoptotischen Zellen eingebaut ist. Die Letztgenannte bewirkt die Entstehung einer Pore, durch die das Cytochrom c ins Cytosol strömen kann.

Die Struktur des monomeren Bax wurde mittels NMR in der Gruppe von Dr. Tjandra ) gelöst. Das Protein ist ein globuläres 21 kDa Protein aus neun α-Helices (α1PDB:1F16 α9), wobei α5 den Kern des Proteins bildet. Gemeinsame Motive der Bcl-2 Proteine sind die Bcl-2 Homologie (BH) Domänen. Vier dieser Domänen sind bekannt, wobei drei (BH1-3) in Bax vorkommen. Außer dieser Domänen gibt es auf Ebene der Primärstruktur kaum Homologien zwischen den Bcl-2 Proteinen und es wurden keine Homologien zu anderen Proteinen gefunden. Im Gegensatz dazu ist die Tertiärstruktur innerhalb der Bcl-2 Proteine hoch konserviert und ähnelt derjenigen einiger bakterieller Toxine (z.B. der C-terminalen Domäne der Colicine). Die Untergruppe der multidomain Bcl-2 Proteine (zu denen Bax gehört) kommt ausschließlich in Wirbeltieren vor. Die anderen Bcl-2 Untergruppen wurden dagegen auch in vielen Invertebratenspezies nachgewiesen. In silico Sequenzanalysen zeigen eine hohe Konservierung der Aminosäuresequenz von Bax. In α2 und der Cterminalen Proteinhälfte (umfasst alle drei BH Domänen) sind sogar 94% bzw. 90% der Aminosäuren konserviert.

Die Struktur der aktiven, oligomeren Baxkonformation ist weitgehend unbekannt. Die Arbeiten von Annis et al. (2) und Garcia Saez et al. (3) zeigten drei membranständige Helices (α5, α6 und α9), die Lage der anderen Helices ist unbekannt.

Die Aufgabenstellung dieser Arbeit ist: Die Bestimmung der strukturellen Veränderungen in Bax während des Übergangs von der inaktiven in die aktive Konformation und insbesondere die strukturelle Untersuchung des oligomeren, aktiven und membranständigen Bax.

Beide Proteinkonformationen wurden mit vielen, verschiedenen biochemischen und biophysikalischen Methoden analysiert (z.B. mit Elektronenspinresonanzmessungen, Elektronen- sowie Rasterkraftmikroskopie und Massenspektrometrie an chemisch modifizierten Baxproteinen).





Folgende Informationen wurden dabei gewonnen:

(A) Die Einnahme der aktiven Baxkonformation beeinflusst nicht die Sekundärstruktur des Proteins.

(B) Membraneinbau und Oligomerisierung führen zu deutlichen Veränderungen in der

Tertiärstruktur von Bax:

• Die lokale Umgebung der Tryptophane (insgesamt sechs, alle in der Cterminalen Proteinhälfte) wird hydrophober.

• Im Oligomer ist der N-Terminus vor α2 zugänglich für Proteasen, im Monomer ist es α9.

• Eine Untersuchung der lokalen Umgebungen der nativen Cysteine von Bax zeigt Oligomerisations-induzierte Veränderungen.

Die Baxaktivierung bewirkte eine Immobilisierung des Spinlabels an C126 (am Ende von α5), sowie eine Abnahme seiner Zugänglichkeit für paramagnetische Quencher und der Polarität seiner Umgebung.

Die Umgebung des Spinlabels an C62 (in der BH3 Domäne in α2) verändert sich durch die Baxaktivierung. Die Zugänglichkeit des Labels für paramagnetische Quencher sinkt nahezu auf null ab, es wird leicht immobilisiert und die Polarität der Umgebung sinkt leicht ab.

• Eine Untersuchung der Zugänglichkeit einiger Aminosäuren in Bax für NHSBiotin zeigt, dass M1 und K21 (in α1) in beiden Konformationen gut zugänglich sind, während sich die Zugänglichkeit von K57, K58 und K64 (alle inα2) durch die Oligomerisierung verschlechtert, wogegen sich die von K119, K123 (in α5) und K128 (Loop zwischen α5 und α6) verbessert.

(C) Chemische und thermische Stabilitätsanalysen zeigen die oligomere Baxkonformation stabiler als die monomere, wobei beide sehr stabil waren.

(D) Zwei BH3 Domänen (α2) bilden eine Kontaktfläche zwischen den Monomeren des Baxoligomers aus.

(E) Distanzmessungen zeigen:

• Die Spinlabel an C126 und C62 liegen in der monomeren Konformation 3,15 nm voneinander entfernt. Die Oligomerisierung verändert die Distanz nur wenig.

• Zwei Spinlabel an C62 liegen im Oligomer 2,4 nm oder mehr als 5 nm von einander entfernt.

• Zwei Spinlabel an C126 liegen im Oligomer 3 nm, 4 nm oder mehr als 5 nm von einander entfernt.

(F) Die Tertiärstruktur der Baxoligomere in Liposomen oder Detergenz zeigt keine deutlichen Unterschiede.

(G) Eine Untersuchung der Quartärstruktur der Oligomere in Detergenz oder Liposomen zeigt die Oligomere in Detergenz verkleinert. Sie bestanden aus einer geraden Anzahl von Monomeren, wobei das größte, identifizierte Oligomer ein Dodekamer war.

(H) In Detergenz bilden sich porenartige Partikel von etwa 4 nm Höhe, ca. 8 - 10 nm äußerem und 2 -3 nm Porendurchmesser. Nach Detergenzentzug zerfallen sie in Dimere oder bilden Aggregate.

(I) Der Einbau von Bax in Liposomen führt zu Löchern im Lipidfilm, die einen Durchmesser von 5 bis zu 20 nm haben.

Mittels dieser Ergebnisse und der bereits vorhandenen Daten zu Bax konnte ein neues, detailreicheres Modell des Baxoligomers erstellt werden. Die wichtigsten Aussagen dieses Modells sind: Bax baut während der Konformationsänderung die Helices α9, α5 und α6 in die Membran ein, wogegen sich die anderen Helices auf die Oberfläche der Lipidschicht legen. Zwei α2 Helices kommen während der Oligomerisierung dicht zusammen und bilden eine Interaktionsfläche zwischen den Monomeren aus. Das Oligomer besteht aus einer geraden Anzahl von Monomeren. Die gebildete Pore ist in Lipid groß genug um Cytochrom c passieren zu lassen und könnte aus einem Baxdodekamer bestehen.

Kapitel 1: EinleitungApoptose, Autophagie, Nekrose – Zelltod in Metazoen

„Life is pleasant, death is peaceful. It’s the transition that’s troublesome” (Isaac Asimov) Das Überleben der mehrzelligen Eukaryoten (Metazoen) hängt von der Fähigkeit - jeder Zelle und des ganzen Organismus - ab, auf veränderte Lebensbedingungen einzugehen.

Schlüsselqualifikationen sind dabei die Kontrolle der Zellzahl durch Zellteilung und Zelltod sowie die Fähigkeit in Hungersituationen hauszuhalten und überflüssiges wieder zuverwerten. Die Regulation dieser Mechanismen erfolgt durch ein komplexes Proteinnetzwerk. In der Erkennung von Stresssignalen (innerhalb der Zelle) und in der Entscheidung, ob und wie eine Zelle stirbt nimmt die Familie der Bcl-2 Proteine eine wichtige Position ein. Stören Fehlregulationen das Gleichgewicht von Zellteilung und Zelltod kann es zu schweren Krankheiten, wie Krebs, Autoimmunerkrankungen (z.B. Multiple Sklerose) oder neurodegenerativen Erkrankungen (Morbus Alzheimer und Parkinson) kommen (4). Auch Viren (z.B. HIV) können das Gleichgewicht stören.

Die strukturelle Untersuchung des proapoptotischen Bcl-2 Proteins Bax ist Kernpunkt dieser Arbeit. Die Deletion von Bax und seines Homologen Bak führt in der Maus zum pränatalen Tod oder ernsten organischen Schäden (5). Folglich sind Bax und Bak essentielle Proteine in Mäusen aber auch in anderen Säugern.

Der Zelltod kann durch mehrere voneinander abweichende Mechanismen ausgelöst und durchgeführt werden. Dabei können unterschiedliche Signalwege eingeschlagen und verschiedene morphologische Veränderungen der Zelle und des umgebenden Gewebes

sichtbar werden. Die wichtigsten Arten des Zelltods sind im Folgenden aufgeführt:

(I) Schädliche Umwelteinflüsse wie Verbrennungen oder mechanische Traumata lösen Nekrosen aus, die sich phänotypisch durch Anschwellen und Platzen von Zellen zeigen (siehe Abbildung 1; links). Dabei diffundieren Zellbestandteile ins umgebende Gewebe und lösen eine Entzündungsreaktion aus, die in schweren Fällen das Überleben des Organismus gefährden kann (6). Sind die im Folgenden beschriebenen Apoptose und Autophagie Mechanismen intakt, minimiert dies Schädigungen des Organismus durch Nekrosen.

(II) Mittels Autophagie werden in Hungersituationen nicht essentielle Proteine und Organelle abgebaut. Die Autophagie kann aber auch zum Tod der Zelle führen. Das Wissen um diesen Zelltod ist neuer und weniger gut verstanden, als die anderen beiden Mechanismen. Die sterbende Zelle baut sich selbst mittels Autophagosomen ab und die Abbaufragmente werden vom umgebenden Gewebe aufgenommen, sodass es zu keiner Entzündung kommt. Die Autophagie wurde in Tieren, Pflanzen

und Pilzen nachgewiesen.

Abbildung 1: Strukturelle Veränderungen einer Zelle während Apoptose (rechts) und Nekrose (links).

Apoptose: Die vormals gesunde Zelle (1) beginnt zu schrumpfen, dabei kondensieren Cytoplasma und Chromatin (2). Im weiteren Verlauf beginnt die Fragmentierung von DNA, Proteinen, Kern, Mitochondrien, … und der Abbau der gesamten Zelle in apoptotische Vesikel (apoptotic bodies), wobei die Integrität der Zellmembran erhalten bleibt (3). Die Vesikel können danach rückstandsfrei von Makrophagen oder Nachbarzellen aufgenommen werden, so dass es zu keiner Entzündungsreaktion kommt (4).Nekrose: Bei Beginn einer Nekrose schwellen die Mitochondrien, sowie die gesamte Zelle an (5). Dabei kommt es zu einer ungeordneten Kondensation des Chromatins, die Zellmembranen wird durchlässig und die Zellbestandteile diffundieren ins umgebende Gewebe (6), in Folge dessen es zu einer Entzündungsreaktion kommen kann [nach(7)].



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 25 |


Similar works:

«Main Sermon Register Thema: [none] Incipit: Ad unionem et reformacionem catholice et universalis ecclesie in hac. Explicit:.ipsius Christi vicarium recte gubernatam quod ipse prestare dignetur. Alternate explicit:.pontifex et cuius causa alitur per infinita secula benedictus. Amen. Preacher: Franciscus Zabarella, cardinalis Florencie Date: 24 July 1415 Manuscripts: Eichstätt, Staatsund Seminarbibliothek, MS 218, pp. 331-332 Oxford, Bodleian Library, MS Canon. Misc. 374, ff. 54r-56v Vaticano,...»

«See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/31033013 Assimilation and Contrast Effects in PartWhole Question Sequences: A Conversational Logic Analysis Article in Public Opinion Quarterly · March 1991 Impact Factor: 2.25 · DOI: 10.1086/269239 · Source: OAI CITATIONS READS 3 authors, including: Norbert Schwarz Fritz Strack University of Southern California University of Wuerzburg 358 PUBLICATIONS 27,400 CITATIONS...»

«2 Rede W.I. Lenins bei Eröffnung des Internationalen Kommunistischen Kongresses am 2. März 1919 Im Auftrag des Zentralkomitees der Kommunistischen Partei Rußlands eröffne ich den Ersten Internationalen Kommunistischen Kongreß. Vor allem bitte ich alle Anwesenden, sich zum Andenken der besten Vertreter der IH. Internationale, Karl Liebknechts und Rosa Luxemburgs, von den Sitzen zu erheben. (Alle erheben sich von den Plätzen.) Genossen! Unsere Zusammenkunft ist von weittragender...»

«Umweltforschungsplan des Bundesministeriums für Umwelt, Naturschutz und Reaktorsicherheit Förderkennzeichen 380 01 005 „Modellhaftes technologisches Konzept für die Verbesserung der Sicherheit bei der Chlorlagerung am Beispiel eines Moskauer Großwasserwerkes in Verbindung mit Maßnahmen zur Verbesserung des anlagenbezogenen Gewässerschutzes“ von Dr. Klaus Ritter Dr. Michael König Euro Institute for Information and Technology Transfer in Environmental Protection GmbH, Hannover...»

«                           Bedienungsanleitung  A.D.J. Supply Europe B.V. Junostraat 2 6468 EW Kerkrade Niederlande www.americandj.eu 1/13 Inhaltsverzeichnis ALLGEMEINE INFORMATIONEN  ALLGEMEINE ANWEISUNGEN  EIGENSCHAFTEN  SICHERHEITSVORKEHRUNGEN BEI HANDHABUNG  SICHERHEITSHINWEISE  EINRICHTUNG DES GERÄTS  INSTALLATION  SYSTEMMENÜ  BETRIEB  NETZKABEL IN SERIENSCHALTUNG  UC3‐STEUERUNG  DMX‐EIGENSCHAFTEN  BETRIEB DER RC1 VON ADJ ...»

«From The Misrepresented Minority: New Insights on Asian Americans and Pacific Islanders and Their Implications for Higher Education Edited by Samuel D. Museus, Dina C. Maramba, and Robert T. Teranishi The following is an excerpt from the unedited manuscript. Chapter 3 To Be Mice or Men: Gender Identity and the Development of Masculinity Through Participation in Asian American Interest Fraternities By Minh C. Tran & Mitchell J. Chang If good humor reflects social realities in society, consider...»

«Produktinformation Product Information Informations de produit MCE 82 Kondensatormikrofon Condenser MIcrophone Microphone Condensateur Sie haben sich für das Stereomikrofon MCE 82 von beyerdynamic entschieden. Vielen Dank für Ihr Vertrauen. Nehmen Sie sich bitte einige Minuten Zeit und lesen Sie diese Produktinformation vor Inbetriebnahme aufmerksam durch. Anwendungen Das MCE 82 ist ein universell einsetzbares Stereomikrofon für X-Y-Aufnahmen. Es eignet sich für allgemeine Stereoaufnahmen...»

«Erregung erzählen Narratologische Anmerkungen zum Porno Andrea B. Braidt Erregung muss erzählt werden, um den ZuschauerInnen Anlass zum empathischen Nachvollzug zu geben. Zeigen als Beschreibungsmodell, so meine Ausgangsthese, wird dem Porno deshalb nicht gerecht, weil das Phänomen der sexuellen Erregung, welches das Genre repräsentieren und als Rezeptionseffekt herstellen will, in Spannungsverläufen organisiert ist. Diese Spannungsverläufe folgen Dramaturgien, die zwar nach individuellen...»

«Bedienungsanleitung Mionic Pre Season Modelle 2011  Mionic  Mionic de Luxe  Mionic Tour Electric Mobility. Evolved. winora -bike**– zaubern Ihnen ein Lächeln ins Gesicht Wir Erfahren Sie die einzigartige Leichtigkeit, mit der Winora E-Bikes jede Tour zum Genuss werden lassen. Maximaler Komfort, Unabhängigkeit, Individualität, Gesundheit, Technologie und Umweltbewusstsein. Inhalt Einführung 04 Beschreibung Winora Mionic Pre Season 2011 Funktionen 06 Packungsinhalt 07 Ihr Winora...»

«„Die Kontrolle der Transkription in den Mitochondrien des Modellorganismus Schizosaccharomyces pombe“ Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der RWTH Aachen University zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation vorgelegt von       Diplom-Biologe Falk Speer aus Herdecke     Berichter: Prof. Dr.rer.nat. Bernd Schäfer Prof. Dr.rer.nat. Klaus Wolf   Tag der mündlichen Prüfung: 05.03.2010 Diese...»





 
<<  HOME   |    CONTACTS
2016 www.book.dislib.info - Free e-library - Books, dissertations, abstract

Materials of this site are available for review, all rights belong to their respective owners.
If you do not agree with the fact that your material is placed on this site, please, email us, we will within 1-2 business days delete him.