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«Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften -Dr. rer. nat.Fachbereich 2 (Biologie/Chemie) Universität ...»

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Investigations into the transcriptome of

the toxigenic marine dinoflagellate

Alexandrium minutum

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

-Dr. rer. nat.Fachbereich 2 (Biologie/Chemie)

Universität Bremen

vorgelegt von

Ines Yang

September 2009

1. Gutachter: Prof. Dr. Ulrich Bathmann

Alfred-Wegener-Institut für Polar- und Meeresforschung, Bremerhaven u.

Universität Bremen

2. Gutachter: Prof. Dr. Dieter Wolf-Gladrow Alfred-Wegener-Institut für Polar- und Meeresforschung, Bremerhaven u.

Universität Bremen Überarbeitete und aktualisierte Version, vorgelegt im Oktober 2010 Contents 1 Summary

2 Zusammenfassung

3 Introduction

3.1 Dinoflagellates – an unusual group of eukaryotes

3.2 Phytoplankton Blooms

3.3 The genus Alexandrium

3.4 Paralytic Shellfish Poisoning (PSP) toxins

3.5 Allelochemical properties of Alexandrium

3.6 Outline of the thesis

4 Manuscripts

4.1 List of Manuscripts

4.2 Declaration of contributions

5 Manuscript 1

6 Manuscript 2

7 Manuscript 3

8 Manuscript 4

9 Synthesis

9.1 Characterisation of the A. minutum transcriptome

9.2 Search for sequences associated with PSP toxicity

9.3 Transcriptome-level processes associated with growth, nutrient status and stress response...180 9.4 Conclusion

10 Future Perspectives

Appendix

I. Manuscript 1, additional file 1: Primer tables and respective PCR conditions

II. Manuscript 1, additional file 3: Phyml-based likelihood trees with bootstrap support values205 III. Manuscript 1, additional file 4: Rarefaction curve

IV. Manuscript 2, Supplementary table: information on the genes up-regulated at Day 1 or Day 3 of copepod-induced PSP toxin production

Danksagung

Summary 1 Summary Dinoflagellates of the A. minutum species complex are widely distributed bloomforming, photosynthetic protists typically producing potent neurotoxins which cause paralytic shellfish poisoning (PSP). Human intoxications usually occur via the ingestion of filter-feeding bivalves, but intoxications after consumption of predatory crabs have also been reported. The same group of toxins is produced by certain freshwater cyanobacteria, in which the gene cluster coding for the PSP toxin-producing enzymes has recently been identified. However, the identification of corresponding genes in dinoflagellates is pending, which might be due to their unusual and little understood genomes.

The aim of this thesis is to contribute to understanding gene expression and regulation in dinoflagellates by investigating the transcriptome-level gene expression in A.

minutum. The gene expression experiments were based on an expressed sequence tag (EST) library, which was generated from pooled samples originating from different treatments to include the highest possible diversity of cDNA sequences. A set of microarray probes based on this library was used for different gene expression experiments, such as the comparison of toxic and non-toxic strains. Three stains were compared at two different times of the light phase, yielding a group of 192 genes differentially expressed between toxic and non-toxic strains at both timepoints.

Another experiment was based on the induction of a fivefold increase in toxin levels by the presence of a copepod grazer. In combination with the data obtained from the strain comparison experiment, this resulted in the identification of two sequences potentially correlated to the ability to produce the toxins.

Summary Other treatments were designed to represent extreme values of ecologically significant parameters, such as different salinities or nutrient limitation. While the transcriptomic differences between cultures acclimatised to different salinities remained moderate and indicated a high prevalence of differences in post-transcriptional processes, the differences among growth phases and between nutrient-replete and nutrient-limited batch cultures were considerable. By using combinations of comparisons, several genes consistently up-regulated at the transition between exponential growth and stationary phase were identified, as well as 87 genes consistently associated with N- or Plimitation.

In the course of this thesis, I identified several A. minutum genes apparently associated with intracellular toxins, as well as patterns of gene expression indicative of culture growth status and of nutrient limitation. These data substantially add to the emerging field of dinoflagellate transcriptomics. Additionally, they provide a starting point for the potential development of new monitoring tools testing the physiological status or toxinproducing potential of A. minutum populations.

Zusammenfassung 2 Zusammenfassung Dinoflagellaten aus dem Artkomplex A. minutum sind weit verbreitete einzellige Phytoplanktonorgansimen, die häufig Massenvorkommen, sogenannte „Algenblüten“, bilden. Die meisten Stämme und Populationen produzieren starke Nervengifte, die paralytische Muschelvergiftungen (paralytic shellfish poisoning, PSP) verursachen können. Meistens werden diese Vergiftungen durch den Verzehr von Muscheln hervorgerufen, die sich zum Teil von giftbildenden Dinoflagellaten ernährt haben. Auch Vergiftungen nach dem Verzehr von räuberischen Strandkrabben sind bekannt. Die gleiche Toxingruppe wird auch von im Süßwasser lebenden Cyanobakterien gebildet, in denen vor Kurzem das Gencluster mit den Enzymen des PSP-Toxin-Biosynthesewegs ermittelt wurde. Die Identifizierung der entsprechenden Gene in Dinoflagellaten steht allerdings noch aus, was wahrscheinlich mit deren ungewöhnlichen Genomen zusammenhängt.





Ziel dieser Arbeit ist es, durch Untersuchung der Genexpression von A. minutum auf Transkriptomebene zum Verständnis der Genexpression und ihrer Regulation in Dinoflagellaten beizutragen. Grundlage der Genexpressions-Experimente war eine EST(expressed sequence tag)-Bank, zu deren Herstellung unter verschiedenen Bedingungen gewachsene Proben kombiniert wurden, um eine möglichst diverse Population von cDNA- Sequenzen zu erhalten. Anhand dieser Bank wurde ein Katalog von Microarray-Sonden erstellt, der dann für verschiedene Genexpressionsexperimente verwendet wurde. Eins dieser Experimente war ein Vergleich zwischen zwei toxischen und einem nicht toxischen Stamm zu zwei unterschiedlichen Zeitpunkten innerhalb der Lichtphase. Anhand dieses Versuchs wurde eine Gruppe von 192 Genen identifiziert, deren Expression zu beiden Zeitpunkten signifikant verschieden zwischen den zwei toxischen und dem nicht-toxischen Stamm war.

Zusammenfassung Bei einem anderen Experiment wurde die durch die Anwesenheit eines Copepoden hervorgerufene Induktion von fünffach erhöhten Toxinwerten innerhalb der Alexandrium-Zellen verwendet. In Verbindung mit den Daten aus dem Vergleich zwischen den verschiedenen Stämmen wurden dabei zwei Sequenzen identifiziert, die mit der Toxinproduktion in Verbindung zu stehen scheinen.

In weiteren Versuchen wurden extreme Werte ökologisch relevanter Parameter wie Salinität oder Nährstoffmangel verwendet. Während die Unterschiede im Transkriptom von an unterschiedliche Salinitäten akklimatisierten Kulturen nicht sehr ausgeprägt waren, aber auf Unterschiede in posttranskriptionellen Prozessen schließen ließen, wiesen Kulturen in unterschiedlichen Wachstumsphasen oder mit unterschiedlicher Nährstoffversorgung beachtliche Unterschiede auf. Durch Kombination paarweiser Vergleiche zwischen verschiedenen Wachstumsbedingungen konnten einige Gene identifiziert werden, deren erhöhte Expression mit dem Übergang von exponentieller zu stationärer Wachstumsphase assoziiert waren. Außerdem wurden 87 Gene identifiziert, deren Expression anscheinend spezifisch auf N- oder P-Mangel reagierte.

In dieser Arbeit identifiziere ich sowohl mehrere A. minutum-Gene, die mit dem intrazellulären Toxingehalt in Zusammenhang zu stehen scheinen, als auch charakteristische Genexpressionsmuster für bestimmte Phasen im Kulturzyklus und für Nährstofflimitation. Diese Informationen sind ein wesentlicher Beitrag zu dem aufkommenden Forschungsfeld der Transkriptomforschung an Dinoflagellaten.

Außerdem sind sie ein Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Systeme zur Überwachung von Planktonpopulationen, die den physiologischen Zustand oder die Fähigkeit zur Toxinproduktion in A. minutum-Vorkommen testen könnten.

Introduction 3 Introduction

3.1 Dinoflagellates – an unusual group of eukaryotes Dinoflagellates are a highly diverse group of protists that can be found in most aquatic habitats worldwide. Exhibiting a wide diversity of lifestyles, they are often major components of both phytoplankton and micrograzer communities. Other species are benthic photo-, mixo- or heterotrophs, and some are symbionts or parasites of different uni- or multicellular organisms.

Photosynthetic dinoflagellates are among the most important phytoplankton groups in marine ecosystems. While exact data on their global biomass production are not available, they occur from the Arctic and Antarctic marine ice brine channels (Montresor et al., 2003; Thomson et al., 2006) to the tropics (Parab et al., 2006). In some instances, dinoflagellates can regularly (Reid et al., 1990) or even permanently (Landry & Kirchman, 2002) dominate the eukaryotic phytoplankton in the marine environment. Although less dominant in freshwater systems, they often contribute significantly to lake phytoplankton Many species are not purely autotrophic but will act as facultative mixotrophs when suitable prey organisms are available (Jeong et al., 2005b). The “zooxanthellae” of various organisms, such as corals, marine flatworms (Lopes & Silveira, 1994), certain foraminifera (Lombard et al., 2009) or radiolarians (Gast & Caron, 1996) are photosynthetic dinoflagellate symbionts.

Similar to the photosynthetic species, heterotrophic dinoflagellates contribute significantly to the heterotrophic plankton worldwide, and can even dominate marine micrograzer communities (Tillmann & Hesse, 1998; Levinsen & Nielsen, 2002; Yang et al., 2004; Vargas & Martínez, 2009). Following an estimate by Dodge (1983), the proportion of heterotrophic dinoflagellates is usually reported to be about 50%. Their Introduction feeding modes can vary considerably (reviewed in Tillmann, 2004). The prey items of the various groups range from bacteria over diatoms and phototrophic or other heterotrophic dinoflagellate species to small metazoa, such as copepod eggs or nauplii.

Some other heterotrophic species are parasites of copepods (Elbrächter, 1988), fish (Landsberg et al., 1994) or other organisms.

3.1.1 The dinoflagellate genome The most unusual feature of dinoflagellates is the peculiar organisation of their genome, which is arguably one of the most bizarre eukaryotic machineries known. Both chromosome numbers and DNA content of core dinoflagellate (“dinokaryote”) nuclei are unusually high; depending on the species, haploid dinoflagellate cells can contain 200 or more chromosomes (Shyam & Sarma, 1978). A survey of genome sizes of freeliving species revealed DNA contents between 3.6 and 225 pg DNA per cell, which corresponds to roughly 1 to 75 times the haploid human value (LaJeunesse et al., 2005).

Most of this DNA is permanently condensed into a liquid crystalline state (Livolant & Bouligand, 1978), which is stabilised by high concentrations of bivalent cations (LeviSetti et al., 2008). This arrangement lacks histones and consequently nucleosomes, but the nuclei contain low abundances of basic histone-like proteins that were acquired by horizontal gene transfer from proteobacteria (Moreno Díaz de la Espina et al., 2005;

Chan et al., 2006). The DNA itself contains high amounts of modified bases. In addition to the methylation of cytosine, which is common in other eukaryotes as well, between 12 and 68% of the dinoflagellate thymine is replaced by the unusual base hydroxymethyluracil.

While dinoflagellates contain the largest known protist transcriptomes - A. tamarense was estimated to have about 40,000 transcribed genes, and evidence for extensive genome duplication coupled with chromosome reorganisation has been reported (Zhang Introduction et al., 2009; Moustafa et al., 2010) - their gene content is considerably lower than would be expected based on genome scale. Their genome sizes appear uncoupled from gene numbers (Moustafa et al., 2010).



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