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«Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von ...»

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Die Transkriptions-Regulation des EGFR-Zielgens pipe

und

Analyse der KASH- und der SUN-Domänen-Proteine

in der Oogenese von Drosophila melanogaster

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades

der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Universität zu Köln

vorgelegt von

Martin Technau

aus Wermelskirchen

Köln, 2007

Berichterstatter/in: Prof. Dr. Siegfried Roth

Prof. Dr. Maria Leptin

Tag der mündlichen Prüfung: 15.02.2008

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis 0HAbkürzungen: 154H1

1: DIE TRANSKRIPTIONS-REGULATION DES EGFR-ZIELGENS PIPE IN

1HTEIL

DER OOGENESE VON DROSOPHILA MELANOGASTER 155H1

Einleitung 2H1.1 156H1 Transkriptionsregulation bei Eukaryonten 3H1.1.1 157H1 Bioinformatische Identifizierung potentieller cis-regulatorischer Motive 4H1.1.2 158H2 Drosophila-Oogenese 5H1.1.3 159H4 Festlegung der Körperachsen während der Oogenese 6H1.1.4 160H5 Der EGFR-Signalweg 7H1.1.5 161H6 Die dorsoventrale Musterbildung des Embryos 8H1.1.6 162H7 Das pipe-Gen 9H1.1.7 163H7 Die Regulation der pipe-Expression in Ovarien 10H1.1.8 164H8 Ziele der Arbeit (1) 11H1.1.9 165H10 Ergebnisse 12H1.2 166H11 Klonale Analyse von Kandidaten-

–  –  –

Teil 1: Die Transkriptions-Regulation des EGFR-Zielgens pipe in der Oogenese von Drosophila melanogaster

1.1 Einleitung 1.1.1 Transkriptionsregulation bei Eukaryonten Als Folge der Sequenzierung diverser tierischer Genome hat sich gezeigt, dass im Durchschnitt die Anzahl der Gene bei Vertebraten nur ungefähr doppelt so hoch ist, wie bei Invertebraten. Diese zunächst überraschende Entdeckung war ein erster wichtiger Hinweis darauf, dass vor allem Unterschiede in der Regulation der Genexpression für die Vielfalt der Organismen und insbesondere für die größere Komplexität höherer Lebewesen verantwortlich sind und nicht ein größeres Repertoire unterschiedlicher Gene. Tatsächlich sind die Mechanismen der eukaryotischen Genregulation weitaus komplexer, als bei prokaryotischen Organismen, bei denen das klassische Operon-Modell eine vergleichbar einfache Erklärung für die Funktion der Genexpression auf molekularer Ebene lieferte (Jacob et al., 1960; Levine and Tjian, 2003).

Eine zentrale Funktion bei der Transkriptionsregulation in Eukaryoten haben Transkriptionsfaktoren, die an spezifische cis-regulatorische Motive (TranskriptionsfaktorBindestellen, TFBS) binden, die in einem sehr variablen Abstand, sowohl proximal als auch distal zur Transkriptions-Initiationsstelle vorkommen können (Arnosti, 2003; Barolo and Posakony, 2002; Lee and Young, 2000). Benachbarte TFBS sind häufig in Form von cisregulatorischen Modulen (CRM) organisiert. Die kombinatorische Wirkung verschiedener, an einem CRM gebundener Transkriptionsfaktoren ist für das resultierende Expressionsmuster in bestimmten Geweben oder Zellen verantwortlich (Arnosti, 2002). CRMs werden auch als Enhancer bezeichnet, obwohl Transkriptionsfaktoren sowohl als positive (Aktivatoren), als auch als negative (Repressoren) Regulatoren der Transkription fungieren (Blackwood and Kadonaga, 1998; Gaston and Jayaraman, 2003; Gray and Levine, 1996b). Oft wird der gesamte cis-regulatorische Bereich eines Gens als Promotor bezeichnet und die direkte Region (~100 bp) um die Transkriptions-Initiationsstelle als Kern-Promotor oder basaler Promotor. Transkriptions-Cofaktoren interagieren mit den DNA-gebundenen Transkriptionsfaktoren und der am Kern-Promotor gebundenen, generellen TranskriptionsMaschinerie (Komplex aus RNA-Polymerase II und so genannten generellen Transkriptionsfaktoren) und bewirken so eine spezifische Regulation der Genexpression (Courey and Jia, 2001; Naar et al., 2001). Eine weitere wichtige Rolle spielt dabei außerdem die Organisation der Chromatin-Struktur, die vor allem über die Modifizierung von Histonen reguliert wird (z.B. Acetylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinierung und Methylierung) (Jenuwein and Allis, 2001; Strahl and Allis, 2000; Thiel et al., 2004).

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1.1.2 Bioinformatische Identifizierung potentieller cis-regulatorischer Motive Für die Vorhersage cis-regulatorischer Motive sind bioinformatische Methoden unerlässlich, eine verlässliche Identifizierung funktioneller Elemente stellt aber immer noch ein großes Problem dar, da regulatorische Sequenzen meist sehr kurz und hoch variabel sind. In den letzten Jahren sind jedoch erhebliche Fortschritte in diesem Zweig der Bioinformatik gemacht worden und zahlreiche, teils sehr unterschiedliche Programme, sind für diese Aufgabe entwickelt worden, die zum größten Teil über das Internet frei zugänglich sind. Vergleicht man die verschiedenen Methoden, nach denen diese Programme arbeiten, so lassen sich diese zunächst nach der Art des benötigten Inputs unterscheiden und in 2 Hauptgruppen einteilen (Elnitski et al., 2006; GuhaThakurta, 2006).

Bei der ersten Gruppe von Programmen muss eine TFBS bekannt sein und entweder als einfache Konsensussequenz, auch als DNA-Sequenz-Muster (sequence pattern) bezeichnet, oder in Form einer PWM (position weight matrix) vorliegen (GuhaThakurta, 2006; Harr et al., 1983; Stormo et al., 1982). Die Darstellung eines Motivs in Form einer PWM stellt dabei eine Verbesserung dar, da in diesem Fall die exakte Motiv-Variabilität mit einbezogen wird, indem die Häufigkeit jeder Base an jeder Position berücksichtigt wird, oder auch indem Nukleotiden, die in einem Motiv nicht vorkommen sollen, „Strafpunkte“ (penalties) zugewiesen werden. Da es nur für eine sehr begrenzte Zahl aller Transkriptionsfaktoren Informationen bezüglich der Sequenz der TFBS gibt (Roulet et al., 1998), lässt sich die Mehrzahl der tatsächlich vorkommenden Motive durch diese erste Gruppe von Programmen nicht identifizieren.





Einen alternativen Ansatz bieten Programme, die tatsächlich nur eine cis-regulatorische Sequenz als Input benötigen, in diesem Fall spricht man auch von einer „ab initio“ oder „de novo“ Motivsuche. Für die ab initio-Suche nach TFBS sind verschiedene Algorithmen entwickelt worden, die größtenteils nach „überrepräsentierten“ Mustern in der DNA suchen (Brazma et al., 1998; Bussemaker et al., 2000; van Helden et al., 1998). Beispiele für häufig verwendete Algorithmen sind der Greedy-Algorithmus (Hertz et al., 1990; Hertz and Stormo, 1999; Stormo and Hartzell, 1989), der EM-Algorithmus (expectation maximation) (Bailey and Elkan, 1995a; Cardon and Stormo, 1992; Lawrence and Reilly, 1990) und der GibbsSampling Algorithmus (Lawrence et al., 1993). Obwohl in den letzten Jahren deutliche Fortschritte bei der Entwicklung neuer Methoden für die ab initio Identifizierung cisregulatorischer Motiven gemacht worden sind, ist die Anzahl falsch positiver Vorhersagen sehr hoch (Jolly et al., 2005; Tompa et al., 2005).

Eine hilfreiche Methode zur Minimierung falsch positiver Vorhersagen, ist die Einbeziehung orthologer Sequenzen. Die steigende Zahl vollständig sequenzierter Genome hat zu einer vielfachen Anwendung komparativer Genomik bei der bioinformatischen Identifizierung von TFBS geführt (Dermitzakis and Clark, 2002; Emberly et al., 2003; Hong et al., 2003). Die Identifikation wichtiger biologischer Signale auf der Basis evolutionärer Konservierung, wird auch als phylogenetic footprinting bezeichnet (Duret and Bucher, 1997; Hardison et al., 1997; Tagle et al., 1988). Diese Methode basiert auf der Annahme, dass funktionale Elemente (zum Beispiel cis-regulatorische Motive) unter Selektionsdruck stehen und deshalb mit einer langsameren Rate evolvieren, als nicht funktionale Sequenzen. Eine als Teil 1: pipe – Transkriptions-Regulation Einleitung phylogenetic shadowing bezeichnete Variante des phylogenetic footprinting verwendet insbesondere die homologen Sequenzen einer großen Zahl nahe verwandter Spezies (Boffelli et al., 2003). Da die Übergänge in den Verwandtschaftsgraden verschiedener Spezies fließend sind, und eine genaue Abgrenzung naher oder fern verwandter Arten daher schwierig ist, verwende ich im Folgenden nur den Ausdruck phylogenetic footprinting. In vielen Fällen hat die Berücksichtigung evolutionärer Konservierung tatsächlich zu einer nachweislichen Verbesserung bei der Identifizierung von TFBS geführt (Blanchette and Sinha, 2001; Frith et al., 2004; King et al., 2005; Loots et al., 2000; Sinha et al., 2004).

Inzwischen sind die Genome von 12 Drosophila-Spezies vollständig sequenziert ((Gilbert, 2007); http://insects.eugenes.org/DroSpeGe/), von evolutionär bis zu 40 Mio. Jahren entfernten Spezies (D. mojavensis, D. virilis, D. grimshawi), bis hin zu sehr nahe verwandten, nur wenige Mio. Jahre entfernten Arten (D. simulans und D. sechellia) (s. Abb. 1.1.1.).

Drosophila ist damit besonders geeignet für bioinformatische Analysen, die auf der Methode des phylogenetic footprinting beruhen.

Abbildung 1.1.1.: Phylogenetischer Stammbaum der 12 vollständig sequenzierten Drosophiliden (aus: Crosby et al., 2007) Für eine endgültige Validierung vorhergesagter TFBS sind experimentelle Daten immer noch unerlässlich (Vavouri and Elgar, 2005). Dabei hat sich insbesondere herausgestellt, dass die häufig beobachtete Bestätigung der Bindung von TF an vorhergesagte TFBS in vitro (Tronche et al., 1997) oft keine funktionale Relevanz besitzt. Die verlässlichste Möglichkeit zur Überprüfung der identifizierten TFBS in einem biologisch relevanten, gewebsspezifischen Kontext, stellen in vivo Experimente dar, insbesondere die Expressions-Analyse von Teil 1: pipe – Transkriptions-Regulation Einleitung Promotor-Reporter-Konstrukten in transgenen Tieren (Hallikas et al., 2006; Khokha and Loots, 2005; Poulin et al., 2005; Shin et al., 2005). Aufgrund der sehr gut etablierten und vergleichsweise wenig zeitaufwendigen Methoden zur Herstellung transgener Fliegen, ist Drosophila auch unter diesem Gesichtspunkt für die Anlayse der Transkriptionsregulation spezifischer Gene besonders gut geeignet.

1.1.3 Drosophila-Oogenese Die paarigen Ovarien von Drosophila bestehen jeweils aus 15-16 so genannten Ovariolen (Abb. 1.1.2.) (King, 1970) (Spradling, 1993).

–  –  –

Abbildung 1.1.2.: Schematische Darstellung einer Ovariole von Drosophila melanogaster. Der anteriore, distale Teil der Ovariole ist links orientiert. (aus: Wolpert, Entwicklungsbiologie, Spektrum Akademischer Verlag, 1999) Die Oogenese beginnt im so genannten Germarium am anterioren Ende der Ovariole mit der Bildung eines Cystoblasten durch die asymmetrische Teilung der Keimbahn-Stammzellen.

Nach vier weiteren unvollständigen mitotischen Teilungen entsteht daraus eine Cyste, bestehend aus 16 über Cytoplasmabrücken miteinander verbundenen Keimbahn-Zellen, der eigentlichen Oocyte und 15 polyploiden Nährzellen, welche die Oocyte mit RNAs und Proteinen versorgen. Während der weiteren Entwicklung werden die Keimbahn-Zellen von den somatischen Follikelzellen umwandert (Margolis and Spradling, 1995), welche für die Synthetisierung der Eihülle (Vitellinmembran und Chorion) verantwortlich sind und eine Schlüsselfunktion bei der Etablierung der Polarität des Embryos haben (s.u.). Die dadurch gebildete Eikammer durchwandert das Germarium weiter in posteriore Richtung, wobei die eigentliche Oocyte eine asymmetrische Position am posterioren Ende der Cyste einnimmt und dadurch die primären Koordinaten der anterio-posterioren Achse festlegt (Huynh and St Johnston, 2004; Spradling, 1993). Einzelne Eikammern werden durch eine Reihe von fünf bis sieben speziellen Follikelzellen, den so genannten „stalk cells“, voneinander getrennt. Die Nährzellen degenerieren gegen Ende der Oogenese (s. Einleitung zu Teil 2). Basierend auf morphologischen Kriterien ist die Oogenese in 14 aufeinanderfolgende Entwicklungsstadien aufgeteilt worden (Abb. 1.1.3.); dabei beschreibt das Stadium 1 die neu gebildete Eikammer im posterioren Bereich des Germariums und das reife Ei charakterisiert das Stadium 14 (Lin and Spradling, 1993).

Teil 1: pipe – Transkriptions-Regulation Einleitung Abbildung 1.1.3.: Ausgewählte Oogenese-Stadien von Drosophila melanogaster. Oben links ist der distale Teil einer Ovariole gezeigt, mit dem Germarium an der anterioren Spitze (G) und jungen Eikammern der Stadien 1-4. Die Eikammern der Stadien 8-14 sind jeweils aus der Ovariole frei präpariert. Anterior ist jeweils nach links orientiert. (King, 1970)

1.1.4 Festlegung der Körperachsen während der Oogenese



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