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«Analyse der kodierenden Nukleotidsequenz des 1 Megadalton extracellular matrix binding proteins von Staphylococcus epidermidis Dissertation zur ...»

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Die AS 4504 - 9407 bestehen aus insgesamt 38 FIVAR-Domänen, welche alternierend mit so genannten GA-Domänen (PFO1468) kombiniert sind. Am C-terminalen Ende von Embp befinden sich insgesamt vier Domänen (DUF1542), deren Funktion zum jetzigen Zeitpunkt noch unbekannt ist. Hinter den DUF1542-Domänen befindet sich eine putative Transmembrandomäne, welche vermutlich eine nicht-kovalente Verbindung zwischen Embp und der Zellmembran realisiert. Eine schematische Darstellung dieser Domänstruktur liefert die Abbildung 10A.

Als Resultat durch die Fusion mit msrR kann in EmbpA ein N-terminal lokalisiertes Exportsignal gefunden werden. Hieran schließt sich eine LytR_cpsA_psr-Domäne (PFO3816) an. Diese Domäne wie auch das Exportsignal werden durch Sequenzen von msrR kodiert. Der LytR-Domäne folgt die Wildtyp-Embp-Organisation (AS-Sequenz 6072 – 10203), welche aus weiteren 27 FIVAR und 26 GA-Domänen besteht. Eine schematische Darstellung der von der Nukleotidsequenz abgeleiteten Domänenstrukturen von Embp liefert die Abbildung 10B.

3 Ergebnisse 50 Abbildung 10: (A): Schematische Darstellung der von der Nukleotidsequenz abgeleiteten Domänenstruktur von Embp. Die Position der Fusion mit MsrR, die bei S. epidermidis 1585-Ra gefunden werden konnte, ist gekennzeichnet. (B) Schematische Darstellung der N-terminalen Domänenstruktur von EmbpA. Bei dieser EmbpIsoform findet sich ein N-terminales Exportmotiv (E), welche von einer LytR_cpsA_psrDomäne (Lyt) gefolgt wird. Beide Domänen werden durch msrR-Sequenzen kodiert. An die LytR_cpsA_psr-Domäne schliesst sich die Embp-Organisation an, die auch bei S. epidermidis 1585 gefunden werden kann. Die beiden schematischen Darstellungen sind nicht maßstabsgetreu.

4 Diskussion 51 4 Diskussion Das humanpathogene Potential von Staphylokokken, vor allem von S. epidermidis, wurde in der Medizin sehr lange Zeit unterschätzt. Der entscheidende Pathogenitätsfaktor von S.°epidermidis ist seine Fähigkeit zur Anlagerung an Polymeroberflächen von implantierten Fremdmaterialien mit anschließender Ausbildung eines mehrschichtigen Biofilms (Rupp et al., 1999a; Rupp et al., 1999b; Rupp et al., 2001). Durch diese Voraussetzungen ist S. epidermidis mehr und mehr in den Focus der modernen Medizin gerückt. Da er sowohl als Erreger von nosokomialen, als auch von Fremdkörperassoziierten Infektionen sehr häufig isoliert wird und dadurch einen erheblichen Anteil am Anstieg der Morbidität und Mortalität nosokomialer Infektionen besitzt (Banerjee et al., 1991; National Nosocomial Infections Surveillance (NNSI) System report, 1999;

Wisplinghof et al., 2003; Karlowsky et al., 2004; Mack et al., 2006a). Bei Fremdkörperassoziierten Infektionen ist S. epidermidis der am häufigsten isolierte Erreger. Allein in Deutschland muss jährlich mit bis zu 100.000 Infektionen gerechnet werden (Mack et al., 2004).

Die Ausbildung des mehrschichtigen Biofilms bietet S. epidermidis Schutz vor Effektormechanismen der angeborenen Immunität (Vuong et al., 2004; Kristian et al., 2008; Mack et al., 2008), der humoralen Immunantwort (Cerca et al., 2007) und vor allem vor Antibiotika (Knobloch et al., 2002; Knobloch et al., 2008), so dass als einzige Therapieoption nur noch die Entfernung des implantierten Materials in Frage kommt (Yuonger et al., 1987; Götz und Peters, 2000; Darouiche, 2005). In den letzten Jahren konnten erhebliche Fortschritte im Hinblick auf das Verständnis der zur Biofilmbildung führenden, molekularen Prozesse gemacht werden. Hierbei wurde vor allem dem intrazellulären Polysaccharid-Adhäsin PIA große Aufmerksamkeit geschenkt. Frühe epidemiologische Untersuchungen konnten eine weite Verbreitung von PIA bei klinischen S. epidermidis Isolaten nachweisen. Dieser Befund war wesentliche Motivation, PIA als Basis eines S. epidermidis-Impfstoffes zu evaluieren (Maira-Litran et al., 2004; Kelley und Quintos, 2006; Cerca et al., 2007). Durch neuere epidemiologische Studien kann jedoch die große Bedeutung von PIA und seinem Transkriptiosort icaADBC für die Biofilmbildung und die Entstehung von Fremdkörper-assoziierter Infektionen in Frage 4 Diskussion 52 getellt werden. Insbesondere ist bemerkenswert, dass in neueren Studien zur Prävalenz von icaADBC bei klinisch signifikanten S. epidermidis Stämmen, die im Zusammenhang mit implantierten Fremdmaterialien isoliert wurden, icaADBC nur in bis zu 50 % der isolierten Stämme nachgewiesen werden konnte. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass eine relevante Zahl von icaADBC-negativen Stämmen in der Lage sind einen Biofilm auszubilden (Klug et al., 2003; Frank et al., 2004; Petrelli et al., 2006; Bradford et al., 2006; Rohde et al., 2007; Henning et al., 2007). Diese Studien weisen darauf hin, dass icaADBC und PIA keine notwendige Voraussetzung für die Invasivität von S. epidermidis im Zusammenhang mit Fremdkörper-assoziierten Infektionen darstellen (Klingenberg et al., 2007). Diese Sichtweise wird dadurch unterstrichen, dass einem tissue-cage Modell definierte icaADBC-Mutanten keine reduzierte Virulenz im Vergleich mit den Wildtypstämmen aufwiesen (Francois et al., 2003; Fluckiger et al., 2005; Chokr et al., 2006).

Daher erscheinen PIA-basierte, mono-valente Impfstoffe als zu kurz gegriffen. Mit dem Ziel, weitere Zielstrukturen für die Entwicklung effektiver Prophylaxestrategien zur Vermeidung von S. epidermidis Infektionen zu entwickeln, ist daher die Untersuchung alternativer Mechanismen der S. epidermidis Biofilmbildung von erheblicher Bedeutung.





Zur Entstehung PIA-unabhängiger Biofilme können verschiedene Faktoren funktionell beitragen (Rohde et al., 2006). Hierbei scheint auch extrazelluläre DNA von Bedeutung zu sein (Izano et al., 2007; Qin et al., 2007; Chaignon et al., 2007). Weitere wichtige Hinweise auf die biochemische Natur der PIA-unabhängigen, interzellulären Adhäsine konnten durch Untersuchungen gewonnen werden, bei welchen etablierte S. epidermidis Biofilme mit einer hochspezifischen, PIA-spaltenden, b-1,6-Hexosaminidase, dem Dispersin B (DspB) (Kaplan et al., 2004; Donelli et al., 2007; Chaignon et al., 2007), oder mit Trypsin behandelt wurden. Hierbei zeigte sich, dass PIA-abhängig gebildete Biofilme des Referenzstamms 1457 durch DspB vollständig zerstört wurden, jedoch stabil gegenüber der Wirkung von Trypsin waren (Qin et al., 2007; Molin et al., 2007; Hennig et al., 2007). Im Gegensatz dazu wurden Biofilme von PIA-negativen Stämmen durch Trypsin zerstört, während DspB keine Desintegration der Biofilme bewirkte (Rohde et al., 2007; Chaignon et al., 2007). Aus diesen einfachen Experimenten kann geschlossen werden, dass PIA-unabhängige Mechanismen bei der S. epidermidis Biofilmbildung unter anderem auf Proteinstrukturen basieren muss. Hierbei konnte die funktionelle Beteiligung 4 Diskussion 53 des Aap (accumulation associated proteine, Aap) bereits gut dokumentiert werden (Hussain et al., 1997; Vandecasteele et al., 2003; Rohde et al., 2004; Rohde et al., 2005;

Petrelli et al., 2006; de Araujo et al., 2006; Stevens et al., 2007; Rohde et al., 2007;

Conrady et al., 2008).

Da jedoch auch aap-negative S. epidermidis Stämme, biofilmassoziierte Infektionen hervorrufen können, müssen weitere Mechanismen bei der durch S. epidermidis vermittelten Biofilmakkululation existieren. Die funktionelle Beteiligung von Embp (extracellular matrix binding proteins, Embp) an der Biofilmbildung konnte durch Isolierung von zwei unabhängigen, biofilmnegativen Tn917-Mutanten des S. epidermidis Stamms 1585-Ra, bei welchen embp als Folge der Transposoninsertion inaktiviert wurde, erstmalig erkannt werden. Durch Sequenzierung der transposonflankierenden Sequenzen konnte gezeigt werden, dass in der Mutante M135 das Transposon an der Position des Nukleotids 21251 und in der Mutante M84 an der Position des Nukleotids 26771 in der Embp-kodierenden Sequenz lokalisiert ist (Christner et al., 2009). Die Lokalisierung ergab sich durch Abgleich mit dem bereits publizierten Genom von S. epidermidis RP62A (Gill et al., 2005). Unklar war jedoch, ob in S. epidermidis 1585 das embp in Bezug auf die Position im Chromosom und auf die Größe des offenen Leserahmens mit dem korrespondierenden Allel in S. epidermidis RP62A (SERP1011) vergleichbar ist. Daher war es ein wichtiges Ziel der hier beschriebenen Eyperimente, das embp-Allel in S.°epidermidis zu charakterisieren.

Um embp dieses Stamms zu sequenzieren, wurden anhand der embp-Sequenz des Stamms S. epidermidis RP62A spezifische Primer generiert, die die Amplifikation von etwa 1000 bp langen, sich überlappenden Fragmenten von embp sowie den flankierenden, chromosomalen Abschnitten erlaubten. Bei der Analyse der Sequenzdaten zeigte sich, dass embp in S. epidermidis 1585 - wie auch bei S. epidermidis RP62A - zwischen zwei putativen offenen Leserahmen, SERP1010 und SERP1012 lokalisiert ist. SERP1010 weist Homologien zu einem für ein Zellwandenzym EbpS kodierenden Gen ebpS auf, während SERP1012 Homologien zu einem für eine Exonuklease ExoS kodiereden Gen exoS aufweist. Wie auch in S. epidermidis RP62A ist die Transkriptionsrichtung von embp parallel zu der des Gens SERP1012, jedoch entgegengesetzt zu der des offenen Leserahmens SERP1010. Der offene Leserahmen von embp umfasst in S. epidermidis 1585 insgesamt 30612 Nukleotide. Somit kodiert embp auch in S. epidermidis 1585 für ein 4 Diskussion 54 aus 10204 Aminosäuren bestehendes Protein mit einem errechneten Molekulargewicht von über 1MDa. Embp ist damit das größte bekannte Protein von S. epidermidis.

Die durchschnittliche Größe bakterieller Gene liegt bei etwa 1000 bp (Skovgaard et al., 2001). Dies legt nahe, dass Gene, die für große Proteine mit einem Molekulargewicht von über 250 kDa kodieren, selten sind. Tatsächlich konnte im Rahmen einer Suche in 580 vollständig sequenzierten, prokaryotischen Chromosomen (zusammen etwa 2071329 offene Leserahmen) insgesamt nur 3732 offene Leserahmen mit einer Größe von mehr als 5000 bp gefunden werden. Dies entspricht einem Anteil von 0,2 % aller offener Leserahmen (Reva und Tümmler, 2007). Nur 41 Gene konnten gefunden werden, die größer als 25 kb sind. Neben Embp in S. epidermidis finden sich diese besonders großen Gene in den humanpathogenen Spezies Legionlla pneumophila, Mycobacterium avium, Nocardia farcinica, Pseudomonas putida, S. aureus und Streptococcus pyogenes.

Zusätzlich besitzen typische Bodenbakterien Gene mit mehr als 5000 bp (Reva und Tümmler, 2007). Funktionell handelt es sich bei der Mehrzahl der durch Riesengene kodierten Proteine um Exportproteine mit adhäsiver und / oder hämolytischer Aktivität (Reva und Tümmler, 2007). So vermittelt das Protein Rtx von Legionella pneumophila die Bindung des Erregers an epitheliale Zellen (Cirillo et al., 2001). Das 900 kDa große Protein LapA von Pseudomonas putida ist an der Bindung an Polystyren und Quarzsand beteiligt (Shannon et al., 2003).

Für das Embp-Homolog Ebh in S. aureus wurde eine Fibronectin-bindende Aktivität beschrieben (Clark et al., 2002), auch dem Embp konnte eine Fibronectin-bindende Aktivität nachgewiesen werden (Williams et al., 2002). Zusätzlich ist Embp als interzelluläres Adhäsin funktionell an der akkumulativen Phase der S. epidermidis Biofilmbildung beteiligt. Hierbei ist es denkbar, dass Embp eine extrazelluläre Matrix bildet, in diese dann die Bakterienzellen integriert werden. Erst kürzlich konnte die Struktur eines Fragments des Embp-Homologs Ebh aufgeklärt werden (Tanaka et al., 2008). Es zeigte sich, dass Ebh aus repetitiven Helices besteht, die mutmaßlich als Bündel entlang der Längsachse von Ebh angeordnet sind. Die Länge eines Moleküls beträgt hierbei etwa 320 nm (Tanaka, et al., 2008). Unter der Annahme, dass sich diese strukturellen Eigenschaften auch bei Embp wieder finden könnten, ist es somit denkbar, dass Embp, vergleichbar mit eukaryoten, extrazellulären Strukturproteinen, wie Fibronectin, eine von den Bakterien gebildete Biofilmmatrix bildet. Eine solche 4 Diskussion 55 extrazelluläre Matrix hat im Zusammenhang mit bakterieller Biofilmbildung insbesondere die Aufgabe, ein für die bakterielle Physiologie günstiges Mikromilieu zu bilden. Aus der abgeleiteten Aminosäuresequenz ergeben sich Hinweise, dass Embp hierfür von Bedeutung sein könnte. So ist Embp nämlich reich an polaren, aliphatischen Aminosäuren wie Glutamat, Threonin, Serin und Asparagin und arm an Lysin und Arginin. Hieraus resultiert, dass es sich bei Embp um ein saures, hydrophiles Molekül handelt, welches in der Lage sein sollte, Kationen und Wasser zu binden. Gerade die Regulation der Homöostase von Wasser und Ionenmilieu ist eine wichtige Aufgabe der extrazellulären Biofilmmatrix (Costerton et al., 1999; O´Toole et al., 2000; Götz et al., 2005).



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