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«Analyse der kodierenden Nukleotidsequenz des 1 Megadalton extracellular matrix binding proteins von Staphylococcus epidermidis Dissertation zur ...»

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Um nun größere strukturelle Veränderungen von embp nachzuweisen zu können, wurden mittels long-range PCR unter Verwendung spezifischer Primer (Tabelle 9) größere embpFragmente amplifiziert (Abbildung 5) und mittels Gelelektrophorese analysiert. Einen schematischen Überblick über die Position der verwendeten Primerpaare liefert die Abbildung 4. Die PCR wurde nach Optimierung der annealing-Temperaturen unter Verwendung chromosomaler DNA der zu vergleichenden Stämme durchgeführt. Bei der Analyse der so erzeugten Amplifikate zeigte sich, dass diese im wesentlichen die gleiche Größe aufwiesen (Abbildung 5). Eine Ausnahme hiervon stellte das Primerpaar embp_12847for und embp_19104rev dar. Trotz mehrfacher Versuche unter unterschiedlichen PCR-Bedingungen konnte mit diesen beiden Primern nur bei S. epidermidis 1585 ein Amplifikat dargestellt werden, während dies bei S. epidermidis 1585-Ra nicht gelang (Abbildung 4). Dies kann als Hinweis auf Veränderungen des embpAllels von S. epidermidis 1585-Ra im Vergleich zu S. epidermidis 1585 gewertet werden.

Zur Darstellung dieser möglichen Sequenzunterschiede sollten daher beide embp-Allele vollständig sequenziert werden.

3 Ergebnisse 42 Abbildung 4: Schematische Übersicht über die verwendeten Primer und deren relative Lokalisation in embp. Die Primer zur Darstellung von embp wurden so gewählt, dass der Anlagerungsort eines reverse Primers jeweils 3´ des darauf folgenden forward Primers lokalisiert ist. Hierdurch konnten überlappende Amplifikate erzeugt werden, die in ihrer Summe den gesamten offenen Leserahmen von embp abdeckten. Es handelt sich im einzelnen um die Primerpaare: 1, 2: SERP_for1020, embp_rev2484; 3, 4: embp_for1723,

embp_rev9212; 5, 6: embp_for6919, embp_rev13552; 7, 8: embp_for12847, embp_rev19104; 9, 10:

embp_for18809, embp_rev27744; 11, 12: embp_for24652, embp_rev27511. Durch Balken werden die jeweiligen Amplifikate repräsentiert. Unter Verwendung des Primerpaars 7, 8 konnte kein Amplifikat erzeugt werden (gepunktete Linie). Die schematische Darstellung ist nicht maßstabsgetreu.

Abbildung 5: PCR zur orientierenden Untersuchung der embp-Allele in S. epidermidis 1585 und S. epidermidis 1585-Ra. Unter Verwendung geeigneter Primer wurden PCR Reaktionen durchgeführt, deren resultierenden Amplikons in der Summe den gesamten offenen Leserahmen von embp in beiden S. epidermidis Stämmen repräsentieren. Die Abbildung zeigt die Analyse der Amplikons mittels Agarosegelelektrophorese in einem 0,5 %igem Agarosegel. Die Banden wurden durch Ethidiumbromidfärbung dargestellt. Der Vergleich der Bandengrößen von S. epidermidis 1585 (Wt) und 1585-Ra (-Ra) zeigt, dass keine relevanten Unterschiede zwischen den beiden Stämmen vorliegen.

3 Ergebnisse 43

3.1 Sequenzierung von embp in den beiden S. epidermidis Stämmen 1585 und 1585 Ra Um die embp-Allele in den beiden Stämmen S. epidermidis 1585 und S. epidermidis 1585– Ra sequenzieren und im Anschluss daran analysieren zu können, wurden unter Verwendung spezifischer Primer etwa 1000 bp große, sich jeweils überlappende Fragmente aus der chromosomalen DNA der beiden S. epidermidis Stämme amplifiziert und anschließend in den linearisierten Vektor pCR4 kloniert. Die Sequenzierung erfolgte dann unter Verwendung der beiden Primer M13for(-20) und M13rev(-29). Die resultierenden Sequenzdaten wurden dann unter Verwendung des Programms VektorNTI (Invitrogen, Deutschland) editiert und durch den Assambly-Algorithmus zu einer fortlaufenden Sequenz zusammengeführt.

Zuerst wurden die Sequenzen des embp-Allels von S. epidermidis 1585 mit dem ebenfalls embp-positiven S. epidermidis Stamm RP62A (SERP1011) verglichen. Das embp-Allel dieses Stammes wurde bereits sequenziert (Gill et al., 2005) und diente daher in dieser Arbeit als Referenzstrang. Es zeigte sich, dass die embp-Allele in den S. epidermidis Stämmen 1585 und RP62A eine Länge von insgesamt 30612 bp aufwiesen. Auf Ebene der Nukleotide fand sich in der weiteren Analyse der beiden S. epidermidis Stämme eine Übereinstimmung von über 99 %. Die Bestimmung der stromaufwärts und stromabwärts von embp gelegenen Sequenzabschnitte zeigte, dass das embp in S. epidermidis 1585 und in S. epidermidis RP62A die identische chromosomale Lokalisation zwischen den Genen SERP1010 und SERP1012 aufweist.

Zur Sequenzierung des embp-Allels in S. epidermidis 1585-Ra wurde eine parallele Strategie angewendet. Hierbei konnten die Nukleotide 1 – 17743 sowie 18213 – 30612 problemlos analysiert werden. Diese embp-Abschnitte wiesen im Vergleich zu embp des Stamms S. epidermidis 1585 keine signifikanten Sequenzunterschiede auf. Durch die Sequenzierung konnte zudem gezeigt werden, dass es keinen Unterschied in der Nukleotidsequenz in den Promotorregion der S. epidermidis Stämme 1585 und 1585-Ra gab. Hieraus konnte geschlossen werden, dass offensichtlich die Ursache der embpÜberexpression unabhängig von Veränderungen des natürlichen embp-Promoters erfolgt ist. Trotz mehrfacher Versuche, unter Verwendung verschiedener Primer gelang es nicht, bei S. epidermidis 1585-Ra den Übergang zwischen Nukleotid 17743 und 18213 zu 3 Ergebnisse 44 amplifizieren und die Sequenz bestimmen zu können (Abbildung 5). Dieser Befund gemeinsam mit den Ergebnissen der long-range PCR-Untersuchungen führten zu der Hypothese, dass der S. epidermidis Stamm 1585-Ra in diesem Bereich von embp in veränderter Form vorliegen muss. Mit dem Ziel, einen alternativen Transskriptionsstart vor Nukleotid 18213 zu bestimmen, sollte das 5´-Ende des embp-Transkript bei dem Stamm S.°epidermidis 1585-Ra näher charakterisiert werden.





3.2 Analyse des Embp-Transkripts in S. epidermidis 1585-Ra mittels RACE-PCR Durch die Sequenzierung des 5´Endes des embp-Transkripts sollte analysiert werden, ob ein alternativer Transkriptionsstart in S. epidermidis 1585-Ra vorliegt. Hierfür sollte eine RACE-PCR-Strategie angewendet werden. Zunächst wurde Gesamtzell-RNA aus den Stämmen S. epidermidis 1585-Ra und der Mutante M84 gewonnen. Um eine optimierte Ligation des 5´linkers zu ermöglichen, wurde aus dieser Präparation die mRNA durch Verwendung des MicrobeExpress®Systems angereichert. Nach Ligation des 5´linkers an die mRNA erfolgte die cDNA-Synthese durch reverse Transkription, unter Verwendung der Primer embprevRT18040 und embprevRT19043 (Abbildung 7). Diese wurde als template in einer PCR unter Verwendung der Primer RACE5´ und embprev18881 eingesetzt. Hierbei konnte mit der cDNA, die nach reverser Transkription mit dem Primer embprevRT19043 erzeugt worden war, ein Amplifikat gefunden werden (Abbildung 6).

Die PCR mit den beiden Primern RACE5´ und embprev18881 und Einsatz der cDNA, welche unter Verwendung des Primers embprevRT18040 generiert worden war, erbrachte kein Amplifikat. (Abbildung 6).

3 Ergebnisse 45 Abbildung 6: Analyse der PCR-Amplifikate unter Verwendung von Primer RACE5´ und embprev18881. Die PCR unter Verwendung von cDNA der beiden Stämme S.°epidermidis 1585-Ra und M84, die durch reverse Transkription mit dem Primer embprevRT18040 generiert worden war, erbrachte keine Amplifikate. Unter Einsatz von cDNA, die mit dem Primer embprevRT19041 generiert worden war, konnte sowohl bei S. epidermidis 1585-Ra als auch bei M84 ein etwa 900 bp großes DNA-Amplifikat nachgewiesen werden.

In der Sequenzanalyse der generierten Amplifikate zeigte sich, dass embp an Position des Nukleotids 18213 mit den Nukleotiden 1 – 461 des Gens msrR in frame fusioniert vorliegt.

Diese Fusion konnte auch durch direkte Sequenzierung der chromosomalen DNA von S. epidermidis 1585-Ra und M84 nachgewiesen werden. Eine schematische Darstellung der Fusion von msrR und embp in S. epidermidis 1585-Ra zeigt die Abbildung 7.

3 Ergebnisse 46 Abbildung 7: Schematische Darstellung der Fusion von msrR und embp in S.°epidermidis 1585-Ra auf Nukleotidebene. Durch Sequenzierung der genomischen DNA von S. epidermidis 1585-Ra konnte eine in frame-Fusion von msrR (Nukleotid 1 – 461, fette Buchstaben) mit embp (Nukleotid 18213 – 30612, unterstrichene Buchstaben) gefunden werden. Vor dem Startkodon von msrR (fett und unterstrichen) konnte die natürliche Promotorstruktur von msrR gefunden werden (einfache Buchstaben).

Durch die beschriebene Fusion von embp mit msrR entstand ein 12858 bp großer offener Leserahmen. Dieser offene Leserahmen kodiert für ein aus 4132 Aminosäuren bestehendes Protein mit einem berechneten Molekulargewicht von 463 kDa. Dieses Molekulargewicht entspricht exakt dem, in der S. epidermidis 1585-Ra gefundenen Embp-Isoform (Christner et al., 2009). Auf Grund dessen ist davon auszugehen, dass es offensichtlich im Stamm S.

epidermidis 1585-Ra durch Rekombinationsereignisse zu einer strukturellen Umlagerung mit daraus resultierender Teilung des Wildtyp-embp in zwei offene Lesereahmen gekommen ist. Diese beiden offenen Leserahmen, werden dann unabhängig von einander exprimiert. Die beiden offenen Leserahmen werden als embpB und embpA bezeichnet.

Eine schematische Darstellung der Organisation des msrR-embp-Hybridgens in S. epidermidis 1585-Ra wird in Abbildung 8 gezeigt.

3 Ergebnisse 47 Abbildung 8: Schematische Darstellung der Organisation des msrR-embp-Hybridgens in S. epidermidis 1585-Ra. Durch Sequenzierung konnte eine Fusion der msrRkodierenden Nukleotide 1 – 416 mit den Nukleotiden 18213 – 30612 gefunden werden.

Hierdurch entsteht ein aus 12858 Nukleotiden aufgebauter offener Leserahmen. Vor dem msrR-embp-Hybridgen finden sich die Gene msrA, fmtC und SERP0929 (kodierend für ein hypothetisches Protein). Hinter dem msrR-embp-Hybridgen liegt der Genort SERP1010.

Die schematische Darstellung ist nicht maßstabsgetreu.

Die weitere Sequenzanalyse von S. epidermidis 1585-Ra zeigte, dass vor dem msrR-embpHybridgen die Gene msrA, fmtC und SERP0929 lokalisiert sind (Abbildung 8). Hinter dem Stopkodon von EmbpA ist das Gen SERP1010 lokalisiert. Der Übergang zwischen SERP0929 und EmbpB (Nukleotid 17743) konnte trotz mehrfacher Versuche nicht amplifiziert werden. Daher kann angenommen werden, dass die in S. epidermidis 1585-Ra vorliegende Insertion deutlich größer als 2500 bp sein muss. Eine schematische Darstellung wird in Abbildung 9 gezeigt.

3 Ergebnisse 48 Abbildung 9: Schematische Darstellung von embp des Stamms S. epidermidis 1585 im Vergleich zu S. epidermidis 1585-Ra. In S. epidermidis 1585 konnte ein 30612 bp großer offener Leserahmen von embp nachgewiesen werden. In S. epidermidis 1585-Ra wird dieser durch eine über 2500 bp große Insertion in zwei offene Leserahmen, embpB (nt 1 –

17743) und embpA (nt 18213 – 30612) getrennt. Die cDNA-Synthese für die nachfolgende RACE-PCR wurde unter Verwendung der beiden Primer embprevRT18040 und embprevRT19043 durchgeführt. Es wird deutlich, dass auf Grund der Insertion nur bei Verwendung des Primer embprevRT19043 eine erfolgreiche cDNA-Synthese durchgeführt werden konnte. Die schematische Darstellung ist nicht maßstabsgetreu.

3.3 Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenz von Embp Die genetischen Daten (Christner et al., 2009) legen die Vermutung nahe, dass es sich bei Embp um ein interzelluläres Adhäsin handeln muß. Um die strukturellen Determinanten dieser Funktion zu verstehen, sollten die, von den Nukleotidsequenzen abgeleiteten Aminosäuresequenzen hinsichtlich des Vorkommens von distinkten Domänen analysiert werden. Die Analyse wurden mittels der SMART-Software (http://smart.emblheidelberg.de) durchgeführt.

3 Ergebnisse 49 3.3.1 Analyse der Aminosäuresequenz bezüglich des Vorhandenseins von definierten Domänen Die Analyse der Nukleotidsequenz mittels der SMART-Software (http://smart.emblheidelberg.de) ergab, dass Embp aus insgesamt 10204 Aminosäuren besteht. Diese sind durch eine hochgradig modulare Struktur charakterisiert.

Am N-terminalen Ende von Embp ist ein charakteristisches, bakterielles Exportsignal lokalisiert. Dieses Exportsignal wird durch ein so genanntes YSIRK-Motiv (AS 58 – 84) gekennzeichnet und findet sich typischerweise bei extrazellulären Proteinen grampositiver Bakterien. An das Exportsignal schließt sich eine Region an, die mehrere coiled-coilDomänen aufweist. Hierauf folgt zwischen AS 2579 - 4497 eine Reihe von 21 repetitiv angeordneten, so genannten FIVAR- (found in various architectures, PFO7554) Domänen.



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