WWW.BOOK.DISLIB.INFO
FREE ELECTRONIC LIBRARY - Books, dissertations, abstract
 
<< HOME
CONTACTS



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 12 |

«Analyse der kodierenden Nukleotidsequenz des 1 Megadalton extracellular matrix binding proteins von Staphylococcus epidermidis Dissertation zur ...»

-- [ Page 4 ] --

1.10 Ziele der Arbeit und Fragestellung Die Fähigkeit zur Biofilmbildung ist der entscheidende Pathogenitätsfaktor von S. epidermidis. Epidemiologische Daten haben gezeigt, dass an der Biofilmbildung nicht nur, wie bislang angenommen, ausschließlich Polysaccharide - wie PIA - beteiligt sind, sondern, dass auch Proteinfaktoren eine interzelluläre Adhäsion und Biofilmakkumulation vermitteln können. Die Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass embp ein wichtiger Faktor für die Entstehung von S. epidermidis Biofilmen sein könnte.

Die Befunde der oben beschriebenen Transkriptionsanalyse von embp lassen die Vermutung zu, dass embp im Stamm S. epidermidis 1585-Ra nicht in einem, sondern in mindestens zwei getrennten offenen Leserahmen (open readimg frames, ORF), mit jeweils unabhängiger Regulationskontrolle organisiert ist. Hierzu passt auch die Beobachtung, dass alle zu einem biofilmnegativen Phänotyp führenden Transposoninsertionen im distalen Drittel des Gens Embp gefunden wurden.

Durch die Sequenzanalyse der embp-Allele in dem biofilm- und embp-negativen Stamm S. epidermidis°1585 und dem biofilmpositiven, embp-exprimierenden Stamm S.°epidermidis 1585-Ra sollte daher geklärt werden, ob es durch größere strukturelle Alterationen zu einer Hochregulation des Gens in S. epidermidis 1585-Ra gekommen ist.

Zudem sollte durch eine in silico-Analyse, der aus der Nukleotidsequenz abgeleiteten Proteinsequenz geklärt werden, ob es einen strukturellen Anhalt für die Funktion von Embp als ein interzelluläres Adhäsin gibt.

2 Material und Methoden 23 2 Material und Methoden

2.1 Material 2.1.1 Geräte

–  –  –

2.1.2 Chemikalien, Plastik- und Einwegeartikel Alle verwendeten Chemikalien wurden, soweit nicht anders angegeben, von den Firmen Merck (Darmstadt, Deutschland), Roth (Karlsruhe, Deutschland) oder Sigma (Taufkirchen, Deutschland) in pro analysi Qualität bezogen. Die Plastikartikel und Einwegmaterialien stammten, wenn nicht anders angegeben, von den Firmen Becton Dickinson (Cockeysville, USA), Eppendorf (Hamburg, Deutschland) Greiner (Nürtingen, Deutschland) und Nunc (Roskilde, Dänemark).

2.1.3 Nährmedien Alle Nährmedien wurden in vollentionisiertem Wasser (VE) angesetzt und durch Erhitzen (15 min, 121 °C, 3,0 bar) in einem Dampfautoklaven sterilisiert. Zur Herstellung von Festmedien wurde den Flüssigmedien, soweit nicht anders erwähnt, 15 g/l Bacto®-Agar (Difco, Detroit, USA) hinzu gegeben. Die verwendeten Grundsubstanzen und die fertigen Trockenmedien wurden, sofern nicht gesondert angegeben von den Firmen Becton Dickinson (Cockeysville, USA) Difco (Detroit, USA) oder Oxoid (Basingstoke, England) bezogen.

2 Material und Methoden 25

BHI-Agar:

30 g/l Brain Heart Infusion Broth 2 g/l Bacto-Agar

Blut-Agar:

42 g/l Columbia-Agar 1 g/l Bacto-Agar 2,2 g/l Glukose 72 ml/l Schafsblut

Einfriermedium:

100 ml 1,5 % (wt/vol) Bacto-Pepton 60 ml Glycerin 87% Die Bestandteile wurden getrennt autoklaviert und anschließend zusammengefügt.

Luria-Bertani-Medium (LB):

10 g/l Trypton 5 g/l Hefeextrakt 10 g/l NaCl Gegebenenfalls wurden dem Medium15g/l Bacto-Agar zugefügt.

–  –  –

Trypton Soja Brühe (TSB):

30 g/l TSB (Becton Dickinson) ph 7,3 2.1.4 Lösungen und Puffer Alle Lösungen und Puffer wurden, sofern nicht anders angegeben, in vollentionisiertem (VE) Wasser angesetzt und in einem Dampfautoklaven (15 min, 121 °C, 3,0 bar) sterilisiert.

DNA-Gelladepuffer:

0,25 % [wt/vol] Bromphenolblau 0,25 % [wt/vol] Xylen Cyanol FF 15 % [wt/vol] Ficoll Die Lösung wurde ohne Sterilisation verwendet.

Ethidiumbromid-Stammlösung:

Es wurde eine Ethidiumbromidlösung mit 10 mg/ml in dH2O angesetzt und ohne Sterilisation verwendet.

–  –  –

TE-Puffer:

10 mM Tris-HCI 1 mM EDTA pH 8,0 X-Gal-Lösung 40 mg/ml 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galaktosid in Dimethylformamid 2.1.5 Antibiotika Zur Selektion wurden die Medien mit unterschiedlichen Antibiotika in verschiedenen Konzentrationen supplementiert (Tabelle 3). Sämtliche Antibiotika wurden bei Sigma (Taufkirchen, Deutschland) bezogen.

–  –  –

2.1.7 Reagenztests für molekularbiologische Standardverfahren Die angegebenen Reagenziensets sind in der (Tabelle 5) zusammengefasst. Sie wurden von den Firmen Beckmann Coulter (Krefeld, Deutschland), Eppendorf (Hamburg, Deutschland), Finnzymes (Espoo, Finnland), Invitrogen (Carlsbad, USA), Qiagen (Hilden, Deutschland) und Roche (Mannheim, Deutschland) bezogen.

–  –  –

2.1.9 Oligonukleotide Alle Oligonukleotide wurden von der Firma MWG-Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert. Die verwendeten Oligonukleotide zum Vergleich der Promtorregion sind in Tabelle 7, die für die RACE sind in Tabelle 8 und die Oligonukleotide zur embpSequenzierung sind im Anhang in der Tabelle 9 dargestellt.

–  –  –

2.1.10 Datenbanken und Programme Die durch PCR und Sequenzierungsreaktionen gewonnenen DNA-Sequenzen wurden mit Hilfe des Programms Vector NTI (InforMax, Oxford, UK), und mittels der SMARTSoftware (http://smart.embl-heidelberg.de) bearbeitet und analysiert. Hierbei wurde auf das vollständig sequenzierte Genom des S. epidermidis Stamms RP62A zurückgegriffen (Lokus Nummer CP000029; http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).





2 Material und Methoden 32

2.2 Methoden 2.2.1 Allgemeine mikrobiologische Methoden 2.2.1.1 Anzuchtbedingungen Bakterien wurden zur Stammhaltung auf Agarplatten kultiviert, welche - falls nötig - mit einem Antibiotikum supplementiert wurden. Staphylokokkenstämme wurden auf Blutagar und E. coli Stämme wurden auf LB-Agar kultiviert. Alle verwendeten Bakterienstämme wurden in der Regel für 24 h bei 37°C, sofern nicht gesondert angegeben, in einem Brutschrank (Agarkulturen) oder als Flüssigkultur in einem Schüttelinkubator bei 150 rpm kultiviert und anschließend bei -4°C gelagert. Bei Bedarf wurden den Agarmedien zur Selektion Ampicillin (100 µg/ml) und Kanamycin (50 µg/ml) zugesetzt. Vorkulturen wurden entweder für 6 h oder über Nacht inkubiert und anschließend für die Hauptkulturen 1:100 im gewünschten Medium verdünnt. Für die längerfristige Aufbewahrung wurden die Bakterien in 500 µl Einfriermedium suspendiert und bei -80°C gelagert.

2.2.2 Molekularbiologische Methoden 2.2.2.1 Präparation chromosomaler DNA aus S. epidermidis Zur Präparation chromosomaler DNA aus S. epidermidis wurde das QIAamp®-DNA-Mini Kit (Qiagen, Deutschland) gemäß den Herstellerangaben angewendet. Zur Vorkultur wurden 2 ml BHI mit einer Kolonie des zu untersuchenden Stammes beimpft und über Nacht bei 37 °C und 120 rpm in einem Schüttelinkubator inkubiert. Gegebenenfalls wurden zur Selektion Antibiotika hinzugegeben. 500 µl der Vorkultur wurden in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen überführt und zur Bakterienernte bei Raumtemperatur für 1 min. bei

16.100 x g zentrifgiert und der Überstand dekantiert. Das entstandene Bakterien-Pellet wurde anschließend in 180 µl TE-Puffer (pH 7,0) resuspendiert, 5 µl Lysostaphin (1.500 U/ml) dazugegeben und in einem Heizblock für 1 h bei 37°C inkubiert, um die Bakterienzellwand zu lysieren. Im Anschluss daran wurden 180 µl ATL-Puffer und 20 µl Proteinkinase K (Kit) hinzugefügt, durch kräftiges Mischen auf dem Vortexer vermischt und für 2 h bei 56°C inkubiert. Nach Zugabe von 200 µl AL-Puffer, erneutem Mischen auf 2 Material und Methoden 33 dem Vortexer und Inkubation für 10 min bei 75°C in einem Heizblock wurde der Ansatz abermals zentrifugiert. Daran schloss sich eine Fällung mit Ethanol an, wofür dem Ansatz 200 µl Ethanol abs. zugegeben, erneut gemischt und zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde auf eine Säule gegeben und in ein Eppendorf-Röhrchen gesetzt, 500 µl AW 1-Puffer zugegeben und erneut für 1 min bei 16.100 x g zentrifugiert, wieder in ein neues Eppendorf-Röhrchen gesetzt und nach Zugabe von 500 µl AW 2-Puffer nochmals für 1 min bei 16.100 x g zentrifugiert. Die Säule wurde in ein sauberes 1,5 ml EppendorfRöhrchen gesetzt und zur Trocknung der Säule bei 16.100 x g zentrifugiert. Anschließend wurden 200 µl AE-Puffer auf die Säule gegeben und erneut zentrifugiert. Dieser Schritt wiederholte sich, die Säule wurde verworfen und die gereinigte DNA in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen überführt und im Kühlschrank bei -20°C gelagert.

2.2.2.2 Polymeraskettenreaktion (PCR) Die Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) ist eine Standardmethode zur Amplifikation von DNA-Fragmenten (Saiki et al., 1985). Üblicherweise wurde die PCR mit Hilfe der TripleMaster®PCR (Eppendorf, Deutschland) in einem DNA Thermal Cycler (MWG Biotech, Deutschland) mit beheiztem Deckel nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Das TripleMaster®PCR System enthält eine proofreading DNAPolymerase mit inhärenter Exonukleaseaktivität, die gegebenenfalls auftretende Synthesefehler reparieren kann, so dass eine höhere Genauigkeit gewährleistet werden kann.

Bei der PCR dient die doppelsträngige DNA als Vorlage (template). Gegenläufige (forward und reverse) Oligonukleotide, die so genannten Primer, dienen der DNAPolymerase als Start. Durch abwechselnde Zyklen von Denaturierung der DNA, Anlagerung der Primer (annealing) und Synthese des komplementären Stranges kommt es zur exponentiellen Amplifikation des vorliegenden Fragments. In ein 50 µl Ansatz wurde circa 100 bis 200 ng template DNA, forward- und reverse Primer in einer Konzentration von 10 pM/µl, dNTPs mit je 200 µM, 1 U Polymerase und der zugehörige Mg2+-haltige Puffer (1,5 mM) eingesetzt. Initial wurde die DNA dann für 2 min bei 94°C denaturiert, in den anschließenden Zyklen nur für 30 s. Für die Anlagerung der Primer wurde, in die annealing--Temperatur, in Abhängigkeit der verwendeten Primer, für 30 s auf Temperaturen zwischen 55°C und 65°C abgesenkt. Der Zweitstrang wurde bei 72°C 2 Material und Methoden 34 synthetisiert, wobei sich die Dauer nach der Länge des zu amplifizierenden DNAFragments richtete und mit etwa 40 s/kb angesetzt wurde. Nach in der Regel 30 bis 35 Zyklen schloss sich eine siebenminütige Synthesephase an, um eine vollständige Komplementierung aller Einzelstränge zu gewährleisten. Anschließend wurden die Proben auf 4°C heruntergekühlt. Die Kontrollen der PCR fanden durch Gelelektrophorese statt.

Sollte die amplfizierte DNA kloniert werden oder war die PCR mit dem TripleMaster®PCR System negativ, so wurde als Alternative das Phusion HighFidelity®PCR-Kit (Finnymes, Finnland), welche eine 3´-5´ exonuklease proofreading Aktivität besitzt, gemäß Herstellerangaben verwendet.

2.2.2.3 Klonierung von PCR-Produkten Eine Klonierung von PCR-Amplifikaten erfolgte mit Hilfe des TOPO TA®Cloning Kits (Invitrogen, K4700, Vers. J) nach Angaben des Herstellers. Dabei besitzt der linearisierte Vektor pCR4-TOPO beidseitig so genannte 3’-Desoxyadenosin-Überhänge. Mittels der Topoisomerase I wurden Vektor und Amplifikate ligiert und danach in chemisch kompetente E. coli TOP10 Zellen transformiert. Da die multiple cloning site des Vektors in einem lacZ Gen liegt, konnten Klone mit erfolgreicher Insertion anhand eines blue/white screenings identifiziert werden (Sambrook et al., 1989). Es wurden 1 bis 4 µl eines PCRAmplifikats und 1 µl Salzlösung (Kit) mit sterilem dH2O auf 5 µl aufgefüllt und mit 1 µl pCR4-TOPO Vektor gemischt. Die Ligation fand für 30 min bei Raumtemperatur statt.

Anschließend wurde der Ansatz auf Eis gestellt.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 12 |


Similar works:

«2009-10 Committee on Research Special Research Grants 2009-2010 Pranav Anand, Linguistics Matt Wagers, Linguistics The Distribution and Comprehension of Implicit Arguments A core question in linguistics is how expressions are built from functions and their arguments, e.g. verbs and nouns. Generally all of a function’s arguments must be pronounced. Certain arguments may remain implicit (i.e., unpronounced), but only as long as they are recoverable from prior discourse. This project...»

«VOLUME #1: Roots Hey Change Maker, Meegwich, for picking up this resource. Merci, for all the ways that you’re invested in learning about and practicing anti-oppression. Thank you for having the courage to prevent discrimination and fight for equality. Gracias, for your commitment to building equitable access to resources in your work, community & personal life. Shishi for believing in the possibility of healthier ways to live and love together. Asante sana for the ways you are resilient....»

«Strike rules in the EU27 and beyond A comparative overview Wiebke Warneck European Trade Union Institute for Research, Education and Health and Safety (ETUI-REHS) Brussels, 2007 Brussels, 2007 © Publisher: ETUI-REHS aisbl, Brussels All rights reserved Print: ETUI-REHS Printshop, Brussels D/2007/10.574/16 ISBN: 978-2-87452-087-7 (print version) ISBN: 978-2-87452-088-4 (pdf version) The ETUI-REHS is financially supported by the European Community. Table of contents Introduction Comparative...»

«Under the Factories and Industrial Undertakings (Safety Officers and Safety Supervisors) Regulations Application 1. Application for registration as a safety officer under the Factories and Industrial Undertakings (Safety Officers and Safety Supervisors) Regulations shall be made in a prescribed application form FORM 1.2. The prescribed application forms are downloadable from the Labour Department’s homepage (http://www.labour.gov.hk/) and obtainable free of charge from every branch office of...»

«Fragen und Antworten zu invasiven Pneumokokkenerkrankungen bei Kindern und Jugendlichen Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. an der medizinischen Fakultät der Universität Leipzig eingereicht von: Christin Schnappauf, geb. am 11.02.1987 in Schkeuditz angefertigt an der Klinik und Poliklinik für Kinder und Jugendliche der Universität Leipzig Betreuung: Prof. Dr. med. Wieland Kiess Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 09.09.2015 Zum Dank an meine...»

«Aus der Neurologischen Klinik mit klinischer Neurophysiologie (Chefarzt: Prof. Dr. med. M. Naumann) des Klinikums Augsburg, Lehrkrankenhaus der Ludwig-Maximilians-Universität München Bewertung der Aussagekraft der Fluorodeoxyglukose-Positronen-Emissions-Tomographie bei Riesenzellarteriitis Dissertation zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität zu München vorgelegt von Gerlinde Roswitha Brem aus Augsburg Mit Genehmigung der...»

«Panel of Assessors Health and Social Care Professionals Council An Chomhairle um Ghairmithe Sláinte agus Cúraim Shóisialaigh Panels of Assessors Recruitment & Selection Roles and Responsibilities Code of Conduct Health and Social Care Professionals Council Page 1 of 9 Panel of Assessors Contents 1. General Principles 2. Purpose 3. Objectives 4. Equal Opportunities and Diversity 5. Recruitment 6. Selection Criteria 7. Appointments 8. Terms of Engagement and Confidentiality Agreement 9....»

«HealthCures101.com ARTERIEN Arterienverkalkung/Ateriosklerose Alles über Cholesterin und Ablagerungen Unbekanntes Wissen zum Kreislaufsystem Diese Informationen sind eine Zusammenstellung aus wissenschaftlichen Studien, persönlichen Beobachtungen und Forschungen sowie praktischen Ratschlägen. Das Ziel des Buches ist, den Menschen in seine Selbstheilung zu führen, so dass er sich von jeglichen Krankheiten befreien kann. Aus dem Amerikanischen von Heike Michaelsen HAFTUNGSAUSSCHLUSS: Die...»

«Klinik für Orthopädie und Unfallchirurgie der Technischen Universität München Klinikum rechts der Isar (Direktor: Univ.-Prof. Dr. R. Gradinger) Positronen-Emissions-Tomographie mit F-18-Fluordeoxyglucose (FDG-PET) zur präoperativen Infektionsdiagnostik bei Endoprothesenlockerung Veronika Heizer Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Medizin genehmigten Dissertation....»

«ARTICULAR NEUROLOGY A REVIEW Barry Wyke, M.D., B.S. Neurological Laboratory, Royal College of Surgeons of England Physiotherapy Vol. 58, #3, March 12, 1972: pp. 94-99 ARTICULAR neurology is that branch of the neurological sciences that concerns itself with the study of the anatomical, physiological, and clinical features of the nerve supply of the joint systems in various parts of the body. As such, it is clearly of relevance not only to neurologists and neurosurgeons, but also to orthopaedic...»





 
<<  HOME   |    CONTACTS
2016 www.book.dislib.info - Free e-library - Books, dissertations, abstract

Materials of this site are available for review, all rights belong to their respective owners.
If you do not agree with the fact that your material is placed on this site, please, email us, we will within 1-2 business days delete him.