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«Analyse der kodierenden Nukleotidsequenz des 1 Megadalton extracellular matrix binding proteins von Staphylococcus epidermidis Dissertation zur ...»

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1 Einleitung 16 Zudem enthält PIA II noch Phosphat und Ester-gebundenes Succinat, wodurch es einen anionischen Charakter bekommt (Mack et al., 1996a; Vuong et al., 2004a).

Die Bedeutung von PIA für die akkumulative Phase der Biofilmbildung konnte auf Grund einer linearen Korrelation zwischen biofilmpositivem Phänotyp und PIA-Produktion in einer Population von 179 S. epidermidis Stämmen gezeigt werden (Mack et al., 1996b).

In durchgeführten Experimenten in zwei Tiermodellen konnte die Bedeutung von PIA als Virulenzfaktor bei der Entstehung von Fremdkörper-assoziierten Infektionen gezeigt werden. Dafür wurden in einem Maus- und einem Rattenmodell der biofilmpositive, PIAexprimierende Stamm S. epidermidis 1457 und die isogene biofilm- und PIA-negative Mutante 1457 M10 verwendet. In beiden Tiermodellen konnte gezeigt werden, dass der Wildstamm S. epidermidis 1457 signifikant häufiger Infektionen induziert und seltener durch wirtseigene Abwehr eradiziert werden konnte als die isogene Mutante 1457 M10 (Rupp et al. 1999a; Rupp et al. 1999b). Vergleichbar konnte kürzlich demonstriert werden, dass eine PIA-negative Mutante des Stamms S. epidermidis 9142 im C. elegans-Model Virulenz-attenuiert war (Begun et al., 2007).

Das icaADBC-Operon konnte auch in anderen Staphylokkken-Spezies, wie zum Beispiel, S. aureus und S. caprae gefunden werden (Cramton et al. 1999; McKenney et al. 1998;

Allignet et al. 2001). Gleichzeitig wurden homologe DNA-Sequenzen in zahlreichen anderen Koagulase-negativen Staphylokokken nachgewiesen (Moretro et al. 2003;

Nielsdotter-Augustinsson et al., 2007).

1.7 Prävalenz Virulenz-assoziierter Genorte in kommensalen und invasiven S. epidermidis Populationen Studien, die die Verbreitung von Virulenzfaktoren in verschiedenen S. epidermidis Populationen untersuchten, konnten belegen, dass bei schwerwiegenden Infektionen eine wesentlich höhere Prävalenz von icaADBC-positiven Stämmen vorliegt als bei kommensalen S. epidermidis Stämmen (Ziebuhr et al., 1997; Frebourg et al. 2000;

Galdbart et al. 2000). Dies führte zur Schlussfolgerung, dass icaADBC-negative Stämme als apathogen zu betrachten sind (Zhang et al., 2003; Li et al., 2005; Yao et al., 2005). Die Detektion von icaADBC sollte als Marker zur Unterscheidung von invasiven, also humanpathogen und Besiedlungs-Stämmen, die apathogen wären, genutzt werden (Ziebuhr et al., 1 Einleitung 17 1996; Frebourg et al., 2000; Galdbart et al. 2000; Montanaro et al., 2007). Allerdings konnten in weiteren Untersuchungen an exakt definierten Bakterienpopulationen gezeigt werden, dass die Prävalenz von icaADBC bei kommensalen Stämmen hospitalisierter Patienten nach Knochenmarkstransplantation ähnlich hoch war wie in Blutkulturisolaten, die während einer Katheter-assoziierten Infektion isoliert wurden (Rohde et al. 2004). Die Ursache hierfür liegt vermutlich in einem erhöhten Selektionsdruck durch den Gebrauch von Antibiotika und Desinfektionsmittel, der letztlich zur Selektion resistenter kommensaler Staphylokokkenpopulationen führt (Hoiby et al., 1997).

Von besonderer Bedeutung sind Studien, die bei Isolaten von infizierten Endoprothesen nur bei der Hälfte der isolierten S. epidermidis Stämme icaADBC nachweisen konnten (Frank et al., 2004; Rohde et al., 2007; Koskela et al., 2008). Auch in anderen Bakterienpopulationen konnte eine ähnlich niedrige Prävalenz von invasiven icaADBCpositiven S. epidermidis Stämmen gefunden werden (da Silva et al., 2002; Klug et al.

2003; Klingenberg et al., 2007). Aus diesen Beobachtungen lässt sich schließen, dass icaADBC keine unabdingbare Voraussetzung für die Etablierung einer persistierenden, Fremdkörper-assoziierten Infektion durch S. epidermidis ist.

Hinweise hierfür ergeben sich auch durch unabhängig von einander durchgeführten tierexperimentellen Untersuchungen. Diese zeigen, dass in definierten Tiermodellen unter icaADBC-negativen Mutanten keine Virulenzminderung im Vergleich zu den isogenen, icaADBC-positiven Stämmen aufweisen (Francois et al., 2003; Kristian et al., 2004). Diese Befunde weisen deutlich darauf hin, dass es PIA-unabhängige Faktoren geben muss, welche bei der S. epidermidis Biofilmbildung und einer daraus resultierenden Fremdkörper

-assoziierten Infektionen beteiligt sind. Neuere Studien zeigen, dass PIA als interzelluläres Adhäsin durch Proteine funktionell ersetzt werden kann (Rohde et al., 2005; Rohde et al., 2007). Darüber hinaus muss hervorgehoben werden, dass icaADBC und PIA möglicherweise für die Besiedlung der Haut gesunder Menschen entbehrlich ist (Rogers et al., 2008).

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1.8 Alternative, PIA-unabhängige Mechanismen der S.°epidermidis Biofilmbildung Neben PIA spielen weitere, Polysaccharid-unabhängige Faktoren eine Rolle bei der S. epidermidis Biofilmakkumulation. Durch Behandlung von S. epidermidis Biofilmen mit DNase, Protease, sowie Perjodat-Oxidation konnte gezeigt werden, dass Zellwandproteine, Teichonsäuren und extrazelluläre DNA eine Rolle bei der S. epidermidis Biofilmbildung spielen (Rohde et al., 2005; Chaigon et al., 2007; Rohde et al., 2007; Qin et al., 2007).

Das erste näher untersuchte Protein mit interzellulär adhäsiven Eigenschaften ist das Akkumulation assoziierte Protein (accumulation associated protein, Aap), welches durch eine Mitomycin Mutagenese des Stammes S. epidermidis RP62A identifiziert werden konnte (Schumacher-Perdreau et al., 1994). Bei Aap handelt es sich um ein interzelluläres Adhäsin, das an der akkumulativen Phase der Biofilmbildung beteiligt ist (Abbildung 1A) und PIA in dieser Phase funktionell ersetzen kann. Aap ist ein 220 kDa großes Protein, welches aus zwei Domänen besteht und in Form von fibrillären Strukturen auf der S. epidermidis Oberfläche lokalisiert ist (Banner et al., 2007). Die Aap Domäne-A zeigt Homologien zum Oberflächenprotein SasG von S. aureus (Roche et al., 2003; Corrigan et al., 2007). Die Aap Domäne-B ist 140 kDa groß und vermittelt interzelluläre Adhäsion und Biofilmbildung (Rohde et al., 2005; Conrady et al., 2008). Die Domäne-B besteht aus fünf repetitiven Sequenzen, die jeweils 128 Aminosäuren lang sind (Bateman et al., 2005). Nur durch proteolytische Spaltung des nativen Aap erlangt die Domäne-B ihre Funktionsfähigkeit (Hussain et al., 1997; Rohde et al., 2005). Hierbei spielen zum einem Zink-abhängige, homotype Aap-Interaktionen eine Rolle (Conrady et al., 2008), zum anderen scheinen jedoch auch heterotype Wechselwirkungen der Aap Domäne-B mit unabhängigen Zellwandstrukturen beteiligt zu sein (Rohde et al., 2006).





Es konnte gezeigt werden, dass Stämme, die aap exprimieren können, mehr Biofilm bilden als aap-negative Stämme (Hussain et al., 1997; Stevens et al., 2007). In einem Meerschweinchen-Tiermodell konnten Fremdkörper-assoziierte Infektionen mit einer aapnegativen Mutante erfolgreicher eradiziert werden als Infektionen mit dem aap-postitiven Wildtypstamm (Schwank et al., 1998). Neuere Studien belegen die funktionelle Bedeutung von aap für die Biofilmbildung durch S. epidermidis durch Verwendung von spezifischen Antiseren (Sun et al., 2005; Rohde et al., 2005; Qin et al., 2007). Als Pathogenitätsfaktor 1 Einleitung 19 für die Entstehung einer chronischen Mastitis bei Rindern, die durch S. aureus verursacht wurde, konnte das Biofilm assoziierte Protein (biofilm associated protein, Bap) isoliert werden. Bap ist ein 2276 Aminosäuren großes, Zellwand-assoziiertes Protein, welches an der primären Bindung, an der interzellulären Adhäsion und damit an der Biofilmbildung beteiligt ist (Cucarella et al., 2001; Ubeda et al., 2003). Bei humanen S. aureus Isolaten konnte das bap bis heute nicht gefunden werden. Durch Homologierecherche konnte ein bap-Homolog in S. epidermidis RP62A identifiziert werden. Dieses Molekül wird als Bap homologes Protein (Bap homologue protein, Bhp) bezeichnet. Das kodierende Gen bhp war im Kontext von Katheter-assoziierten Infektionen in weniger als 10 % der S. epidermidis Isolate nachweisbar (Rohde et al., 2004). In Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Inaktivierung von bhp in zwei klinischen S. epidermidis Stämmen die Fähigkeit zur Biofilmbildung nicht beeinflusste. Dies lässt die Vermutung zu, dass die Funktion von Bhp für die Biofilmbildung durch andere Determinanten ersetzt werden kann (Lasa und Penades, 2006).

Eine große Bedeutung für die Einschätzung der relativen klinischen Relevanz von einzelnen interzellulären Adhäsinen besitzt die Tatsache, dass viele klinisch signifikante S. epidermidis Isolate parallel die genetische Information für mehrere dieser Faktoren aufweisen (Vandecasteele et al., 2003; Rohde et al., 2004; Yao et al., 2005). Zum einen ist es daher möglich, dass verschiedenen Mechanismen in unterschiedlichen Infektionssituationen relevant werden (Rohde et al., 2007), oder es ist zum anderen möglich, dass die Mechanismen zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Verlauf der Infektion genutzt werden können (Vandecasteele et al., 2003).

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1.9 Voraussetzungen für diese Arbeit Die Vorarbeiten zu der vorliegenden Arbeit beschäftigten sich mit dem S. epidermidis Stamm 1585. Dieser Stamm war aus Blutkulturen eines Patienten mit einer Portkatheterassoziierten Sepsis isoliert worden. Durch Verwendung spezifischer Primer konnte bewiesen werden, dass der S. epidermidis Stamm 1585 icaADBC und aap-negativ ist.

Durch weitere Experimente stellte sich heraus, dass S. epidermidis 1585 keinen Biofilm bilden konnte (Rohde et al., 2004; Rohde et al., 2005).

Durch eine Langzeitbiofilmkultur konnte eine biofilmpositive Subpopulation dieses S.°epidermidis Stammes angereichert werden, welcher als S. epidermidis 1585-Ra bezeichnet wurde. Hierdurch konnte die grundsätzliche Fähigkeit von S. epidermidis 1585 zur Biofilmbildung gezeigt werden. Im Vergleich zum biofilmnegativen Stamm S. epidermidis 1585 wies 1585-Ra keinen Unterschied hinsichtlich der Fähigkeit zur primären Adhäsion an unbeschichtete Polymeroberflächen auf (Christner et al., 2009).

Dies deutet darauf hin, dass die Fähigkeit von S. epidermidis 1585-Ra zur Biofilmbildung auf der Expression interzellulär-adhäsiver Mechanismen beruhen muss. Vorläufige Untersuchungen zeigten, dass diese Protein-abhängig sind. Um nun die an der Biofilmbildung von S. epidermidis°1585-Ra funktionell beteiligten Strukturen identifizieren zu können, wurde eine Transposonmutagenese durchgeführt. Unter Verwendung des Transposons pTV1ts (Yougmann et al., 1983; Shaw und Clewell, 1985) wurden über 3500 Tn917-Mutanten isoliert und bezüglich ihres Biofilmphänotyps untersucht. Es konnten zwei biofilmnegative Mutanten, M84 und M135, identifiziert werden (Abbildung 2). Bei diesen beiden Mutanten konnte eine Insertion des Transposons in einem 30612 bp großen, offenen Leserahmen (open reading frame, ORF) gefunden werden. Dieser kodiert für das putative 1 MDa Embp (extracellular matrix binding protein, Embp) (Williams et al., 2002). Embp wurde bislang Fibronectin-bindende Aktivität zugesprochen.

In einer quantitativen real-time PCR konnte gezeigt werden, dass die Transkription von embp im biofilmpositiven Stamm S. epidermidis 1585-Ra um das 123-fache höher war als im Wildtypstamm S. epidermidis 1585. Gemeinsam mit den Daten der Transposonmutagenese macht dies deutlich, dass der biofilmpositive Phänotyp von S. epidermidis 1585-Ra auf der Expression von embp beruhen muss. Erstaunlicherweise konnte diese Hochregulation nur unter Verwendung von Primern im Bereich jenseits des Nukleotids 1 Einleitung 21 18000 der kodierenden Sequenz gefunden werden (Abbildung 2), während die Verwendung eines 5´ gelegenen Primerpaars embpreal 1 (Abbildung 2) keine Veränderung der embp-Transkription zeigte.

Abbildung 2: Schematische Übersicht über embp und die Lokalisation von Transposoninsertionen in den Mutanten M84 und M135. Die Insertionen sind jeweils im hinteren Drittel von embp lokalisiert. Zahlen gegeben die jeweilige Nukleotidposition an, der Pfeil zeigt die Transkriptionsrichtung des auf Tn917 lokalisierten ermB-Gens an. In S. epidermidis 1585-Ra konnte in quantitativen real time PCR-Experimenten, unter Verwendung der Primerpaare embpreal2, 3 und 4 eine Hochregulation von embp im Vergleich zu S. epidermidis 1585 gefunden werden. Die quantitative Analyse der embpTranskription von S. epidermidis 1585 und –Ra mit Primerpaar embpreal1 zeigte keine Unterschiede. Die schematische Übersicht ist nicht maßstabsgetreu.

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