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«Analyse der kodierenden Nukleotidsequenz des 1 Megadalton extracellular matrix binding proteins von Staphylococcus epidermidis Dissertation zur ...»

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Außerdem besitzen KNS einen weiteren entscheidenden Vorteil, der für sie eine natürliche Resistenz gegenüber Antibiotika und körpereigener Abwehr darstellt. Hierbei handelt es sich um die spezielle Organisationsform der Bakterien, zum einem bei der Anlagerung der Bakterien an das implantierte Fremdmaterial, zum anderen um die Anlagerung der Bakterien untereinander und um die Ausbildung eines mehrschichtigen Biofilms. Die Ausbildung eines mehrschichtigen Biofilms bietet den Bakterien vor allem S. epidermidis Schutz vor Effektormechanismen der angeborenen Immunität (Vuong et al., 2004; Kristian et al., 2008; Mack et al., 2008) vor der humoralen Immunantwort (Cochrane et al., 1988;

Heinzelmann et al., 1997; Knobloch et al., 2002b; Costerton et al., 2003, Cerca et al.,

2007) und vor allem vor Antibiotika (Knobloch et al., 2002a). Biofilme stellen also eine Barriere dar, durch die manche Antibiotikawirkstoffe nur sehr schlecht hindurch diffundieren können. Da zudem die Bakterien innerhalb eines Biofilms sehr langsam wachsen, ist dieses ein weiter Grund für die Resistenz gegenüber bestimmten Antibiotikaklassen (Costerton et al., 1999; Knobloch et al., 2002a).

1.3 Biofilmbildung Die Biofilmbildung ist ein in der Natur weit verbreitetes Phänomen. Es bezeichnet eine Gemeinschaft von Mikroorganismen, die an einer Oberfläche gebunden sind und Mikrokolonien bilden (Abbildung 1A). Diese Mikrokolonien akkumulieren durch Zellaggregation und Einbettung in eine Exopolysaccharid-Matrix zu einem Biofilm (Stoodley et al., 2002) (Abbildung 1B). Die Exopolysaccharid-Matrix wird von den Mikroorganismen selbst synthetisiert (Costerton et al., 1999; O´Toole et al., 2000). Bei einem Biofilm handelt es sich um ein komplexes Gebilde, welches den Bakterien günstige Lebensbedingungen und Schutz vor Umwelteinflüssen bietet (Costerton et al., 2003).

Diese Art des Wachstumsverhalten mit anschließender Ausbildung eines Biofilms wurde erstmalig von Henrici beschrieben (Henrici et al., 1933). Er machte die Beobachtung, dass Süßwasserbakterien nicht planktonisch, sondern an eine Oberfläche gebunden wuchsen.

Auch unterschiedliche Spezies können sich gemeinsam in einem Biofilm organisieren.

Beispiele für gemischte Biofilme finden sind auf Zähnen, wo Streptokokken und anaeroben, gramnegativen Bakterien gemeinsam Biofilmkonsortien ausbilden.

1 Einleitung 11 Pseudomonas aeruginosa und Burkholderia cepacia können gemeinsam in die Lunge von Patienten mit zystischer Fibrose persistieren, dort gemeinsam einen Biofilm ausbilden und so therapieresistente Pneumonien hervorrufen (Costerton et al., 1999).

1.4 Die Biofilmbildung von S. epidermidis Die enge Assoziation zwischen der Implantation von Fremdmaterialen und Infektionen durch S. epidermidis legten die Vermutung nahe, dass S. epidermidis über spezielle Fähigkeiten verfügen muß, die die Besiedlung an die Polymeroberflächen von Fremdmaterial begünstigen. Durch frühe elektronenmikroskopische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass S.°epidermidis in Form von festhaftenden, mehrlagigen Bakterienkonsortien auf ex vivo gewonnen Venenkathetern organisiert sind. Hierbei zeigte sich, dass die Bakterienzellen in einer amorphen extrazellulären Matrix eingebettet sind.

Dieses Phänomen wurde zunächst als Schleimbildung bezeichnet (Bayston und Penny, 1972; Christensen et al. 1982; Peters et al. 1982). Da der Terminus „Schleim“ jedoch bereits als Bezeichnung für nicht-kovalent an Bakterienoberflächen gebundene Polysaccharide verwendet wurde, ist heute der Begriff Biofilmbildung gebräuchlich (Hussain et al. 1993; Mack et al. 2000a). Die Fähigkeit von S. epidermidis, einen mehrlagigen Biofilm auf Polymeroberflächen von implantierten Fremdkörpern auszubilden, ist der entscheidende Pathogenitätsfaktor bei der Entstehung von Katheterassoziierten Infektionen (Christensen et al., 1983; Inman et al., 1984; Dunne et al., 1987).

Fast alle S. epidermidis Stämme können sich an Polymeroberflächen von Fremdmaterialien binden. Jedoch ist die Fähigkeit zur anschließenden Akkumulation und damit zur Biofilmbildung unterschiedlich ausgeprägt, so dass sich S. epidermidis Stämme bezüglich der Quantität des produzierten Biofilms unterscheiden (Pascual et al., 1986; Hogt et al., 1986; Esperson et al., 1990; Muller et al., 1993). Christensen und Mitarbeiter etablierten einen in-vitro-Test in Flüssigkulturröhrchen, mit dem es möglich war, die Biofilmbildung semi-quantitativ beurteilen zu können (Christensen et al., 1982). Dieser so genannte Biofilm-Assay hat entscheidend zum Verständnis bei der Entstehung von S. epidermidis Biofilmen beigetragen.

Verschiedene epidemiologische Studien haben gezeigt, dass es enge Verbindungen zwischen der klinischen Relevanz eines S. epidermidis-Isolates und dessen Fähigkeit zur Biofilmbildung gibt. So finden sich signifikant häufiger biofilmpositive Stämme bei 1 Einleitung 12 Fremdkörper-assoziierten Infektionen, als biofilmnegative Stämme (Christensen et al., 1983; Ishak et al., 1985; Davenport et al., 1986; Dunne et al., 1987; Deighton und Balkau, 1990; Ziebuhr et al., 1997). In Tierexperimenten konnte gezeigt werden, dass es einen engen Zusammenhang zwischen der Virulenz der Erreger und ihrer Fähigkeit zur Biofilmbildung gibt (Rupp et al., 1999a; Rupp et al., 1999b; Rupp et al., 2001). Weitere Arbeiten belegen, dass es bei Infektionen mit biofilmpositiven S. epidermidis-Stämmen signifikant häufiger zu einem antibiotischen Therapieversagen kommt als bei Infektionen, die durch biofilmnegative S. epidermidis-Stämme verursacht werden (Davenport et al., 1986; Diaz-Mitoma et al., 1987; Younger et al., 1987). Durch all diese Arbeiten wird deutlich, dass die Fähigkeit von S. epidermidis zur Biofilmbildung der entscheidende Pathogenitätsfaktor bei der Entstehung von Fremdkörper-assoziierten Infektionen ist.





Die Biofilmbildung von S. epidermidis weist typischerweise eine Zweiphasenkinetik auf (Abbildung 1B). In der schnell verlaufenden primären Bindungsphase kommt es zur Adhäsion der Bakterien an die Polymeroberfläche von implantierten Fremdmaterialien.

Die Adhäsion wird durch unspezifische und spezifische Faktoren beeinflusst (Mack et al., 2006) (Tabelle 1). Es folgt die länger dauernde Phase der Akkumulation und Proliferation.

In dieser sekundären Phase organisieren sich die Zellen zu einem mehrschichtigen Biofilm, wobei die Mehrzahl der Bakterienzellen keinen direkten Kontakt zu der Polymeroberfläche besitzen (Mack et al., 2004). Eine schematische Darstellung der Biofilmbildung ist in Abbildung 1 zu sehen.

1 Einleitung 13 Abbildung 1: Biofilmbildung von S. epidermidis 1457. (A): Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines S. epidermidis 1457 Biofilms, der sich nach 18 h Inkubation auf Edelstahl gebildet hat. Aufnahme von Harris und Richards 2004. (B): Schematische Darstellung des Modells der Biofilmbildung von S. epidermidis (Mack et al. 2005). Es zeigt den zweiphasigen Verlauf. Während der primären Bindung kommt es zur Adhärenz an die Polymeroberfläche des Fremdmaterials. In der zweiten Phase kommt es durch Zellakkumulation zur Bildung eines mehrschichtigen Biofilms, in dem die meisten Bakterienzellen keinen direkten Kontakt mehr zur Polymeroberfläche besitzen.

1.5 Die primäre Bindung von S. epidermidis In der primären Phase der Adhäsion lagert sich S. epidermidis an die Polymeroberflächen von implantierten Fremdmaterialien an. Die primäre Adhäsion ist abhängig von einer Reihe unspezifischer Faktoren wie die Beschaffenheit der Polymeroberflächen, Van-derWaals-Kräfte und hydrophobe Interaktionen zwischen Polymer- und Bakterienoberfläche (Ludwicka et al., 1984; Hogt et al. 1986; Pascual et al., 1986; Jansen et al., 1989; Fleer and Verhoef, 1999; Mack et al., 2001). Vor allem in vivo spielen zusätzlich Interaktionen mit wirtseigenen Proteinen, wie zum Beispiel Albumin, Fibrinogen, Fibronectin, Kollagen und Vitronectin eine Rolle, denn diese werden bereits kurz nach Implantation in großen Mengen auf der artifiziellen Oberfläche abgelagert (Vandaux et al., 1989; Wang et al., 1993; Kloos and Bannermann, 1994; Esperson et al., 1994).

In den letzten Jahren konnte eine Vielzahl spezifischer Faktoren beschrieben werden, die durch Vermittlung der Bindung an diese Proteine an der primären Adhäsion von S. epidermidis beteilig sind (Tabelle 1) So wurde das Kapselpolysaccharid/Adhäsin (capsular polysaccharide/adhesin, PS/A) als funktioneller Faktor für die Bindung von 1 Einleitung 14 S. epidermidis an Silikonkathetern beschrieben (Muller et al., 1991; Tojo et al., 1998;

Higashi et al., 1998).

Das S.°epidermidis Autolysin E (AtlE) vermittelt die Bindung an das extrazelluläre Matrixprotein Vitronectin und an Polystyroloberflächen (Heilmann et al., 1996; Heilmann et al., 1997). Daneben vermittelt das Autolysin/Adhäsin (Aae) eine Bindung an Fibrinogen, Fibronectin und Vitronectin (Heilmann et al., 2003).

Das S. epidermidis Oberflächenprotein 1 (Staphylococcal surface protein, Ssp 1) findet sich in einer Fimbrien-ähnlichen Struktur auf der Zelloberfläche und vermittelt die Bindung an Polystyrol (Timmerman et al., 1991; Veenstra et al., 1996). Auch konnte ein spezifisches, Fibrinogen-bindendes Protein (fibrinogene binding proteine, Fbe) identifiziert werden (Nilsson et al., 1998; Pei et al., 1999; Hartfort et al., 2001; Pei and Flock, 2001) Die Interaktion von S. epidermidis mit Fibronectin hingegen wird vermutlich durch das extrazellulär bindende Oberflächenprotein Embp (extracellular matrix binding protein, Embp) vermittelt (Williams et al., 2002). Bei dieser Interaktion scheinen zusätzlich Teichonsäuren beteiligt zu sein (Hussain et al., 2001). Für die extrazelluläre S. epidermidis Lipase (GehD) konnte gezeigt werden, dass diese zusätzlich als Zellwand-assoziiertes Kollagen-Adhäsin fungiert (Bowden et al., 2002).

Die bekannten spezifischen Faktoren für die primäre Adhäsion von S. epidermidis an Polymeroberflächen von Fremdmaterialien sind in der Tabelle 1 zusammengefasst.

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1.6 Die akkumulative Phase der S. epidermidis Biofilmbildung Die akkumulative Phase der Biofilmbildung verläuft im Vergleich zur primären Adhäsionsphase langsamer. In der sekundären Phase formiert sich der mehrschichtige Biofilm, in dem nur die wenigsten Zellen im direkten Kontakt zu der Polymeroberfläche der implantierten Fremdmaterialien stehen (Abbildung 1B). Somit sind solche Faktoren, die die Adhäsion der Zellen in einem Biofilm untereinander vermitteln, eine wesentliche Voraussetzung für die Ausbildung der komplexen Biofilmstruktur.

Als ein wichtiger Faktor im Prozess der interzellulären Adhäsion wird das interzelluläre Polysaccharidadhäsin polysaccharide intracellulare adhesin (PIA) beschrieben (Mack et al. 1992; Mack et al. 1996b). PIA wird durch die Genprodukte des vier Gene umfassenden icaADBC Lokus (intercellular adhesion ADBC) synthetisiert. Das icaADBC-Operon besteht aus vier, in gleicher Transkriptionsrichtung organisierten Genen, dem icaA, icaD, icaB, icaC (Heilmann et al., 1996; Gerke et al., 1998), dessen Genprodukte PIA synthetisieren. Dem ica-Operon ist das Gen icaR vorgelagert, welches als Repressor fungiert (Conlon et al., 2002). Die Funktion von IcaA entspricht der einer NAcetylglucosaminyltransferase, welches die Anwesenheit von IcaD benötigt, um volle Aktivität entfalten zu können (Gerke et al., 1998). IcaB hat die Funktion einer Deacetylase, es wird sekretiert und findet sich im Kulturüberstand (Vuong et al., 2004a). IcaC ist ein Transmembranprotein, das am Export von PIA beteiligt ist (Heilmann et al., 1996).

Sowohl für S. epidermidis als auch für S. aureus konnte gezeigt werden, dass die Höhe der icaADBC-Transkriptionsaktivität nicht direkt mit der produzierten PIA Menge korreliert (Dobinsky et al., 2004).

Mittels Ionenaustauschchromatographie lässt sich PIA in die zwei unterschiedlichen Fraktionen, PIA I und PIA II auftrennen, wobei PIA I mehr als 80 % der Gesamtmenge ausmacht (Mack et al., 1996a; Mack et al., 1996b) Durch eine NMR-Spektroskopie und durch chemische Analysen konnte PIA I als ein lineares Homoglykan, das aus durchschnittlich 130 ß-(1,6)-verknüpften 2-Desoxy-2-amino-D-glukopyranosyl-Einheiten besteht, charakterisiert werden. Im Durchschnitt sind 15 bis 20 % der Zuckereinheiten nicht-acetyliert und dadurch positiv geladen. Die positive Ladung ist ein wichtiger Aspekt für die Funktionalität von PIA I (Mack et al., 1996a). PIA II ist strukturell sehr eng mit PIA I verwandt, wobei in PIA II durchschnittlich mehr Glukosamin-Reste acetyliert sind.



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