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«Direktor: Professor Dr. med. Dietrich Reinhardt Der Einfluss von Alpha-1-Antitrypsin Inhalation auf die neutrophile Entzündungsreaktion bei ...»

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4.2 Präanalytische Einflüsse und Reliabilität Untersucht wurden Einflussfaktoren, die durch die Aufbereitung der IS Proben mit DTT und der Lagerungszeit der Proben entstehen könnten. Die in dieser Studie untersuchten Oberflächenmarker wiesen nach zwölfstündiger Lagerung bei 4ºC eine ähnliche Expression auf wie bei sofort nach Induktion erfolgter Analyse. Es wurde kein Einfluss von DTT auf die Expression der untersuchten NG Rezeptoren gefunden. Sowohl für NG, die aus dem peripheren Blut (PB) isoliert wurden, als auch für IS NG ergaben sich keine signifikanten Veränderungen durch DTT. Die Behandlung der Proben mit DTT zeigte ebenso keinen signifikanten Einfluss auf die Konzentrationen von IL-8, TNF-α, IL-1β und LTB4 im IS Überstand. Bei zwanzig CF Patienten wurden die NG sowohl mittels Zytospin, als auch mit Hilfe der Durchflusszytometrie analysiert. Die Prozentsätze von NG im IS korrelierten positiv mit dem prozentualen NG Anteil, welcher differentialzytologisch mittels Zytospin ermittelt wurde (Abbildung 1). Aufgrund der hohen Korrelation und Reproduzierbarkeit (r=0.82, p 0.01) und der methodologischen Vorteile der Durchflusszytometrie, wurden alle weiteren IS Proben per Durchflusszytometrie analysiert.

–  –  –

Abbildung 1: Prozentsätze für NG in IS, gemessen durch Zytospin und Durchflusszytometrie (FCM) 4.3 Alpha-1-Antitrypsin und neutrophile Elastase Wir untersuchten die IS Proben hinsichtlich der AAT Konzentration und der Aktivität der NE.

Dabei ergaben sich für die AAT Konzentration im IS folgende Befunde:

–  –  –

Wie in Abbildung 2 gezeigt, stieg die AAT Konzentration im IS nach zwei und nach vier Wochen AAT Therapie, im Vergleich zu der Messung vor Studienbeginn, signifikant an. Dies bedeutet, dass die inhalative Therapie mit AAT zu einem robusten Anstieg von AAT im IS führte. Um zu sehen, ob die Erhöhung des AAT mit einer Erniedrigung der NE vergesellschaftet war, analysierten wir die Aktivität der NE im IS vor bzw. zwei und vier Wochen nach AAT Therapie.

Für die Aktivität der NE im IS ergaben sich folgende Befunde:

Abbildung 3: Aktivität der freien Elastase in induziertem Sputum vor Beginn der Behandlung, sowie nach zwei und vier Wochen AAT Inhalation Im IS war die Aktivität der NE nach vier Wochen signifikant erniedrigt (p0.05), wobei sich nach zweiwöchiger AAT Therapie noch kein Effekt zeigte.

4.4 Neutrophile Granulozyten Um zu überprüfen, ob die Inhalation mit AAT einen Einfluss auf die NG, die eine zentrale Stellung im Entzündungsgeschehen der CF Lunge einnehmen aufwies, untersuchten wir diese im IS dieser Patienten. Dabei ergaben sich für die prozentualen Anteile der NG im IS

folgende Befunde:

Neutrophile (%)

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Der prozentuale Anteil der NG in den IS Proben sank nach vier Wochen der Inhalation mit AAT signifikant (p0.05) (siehe Abbildung 4). Dies deutet darauf hin, dass die AAT Inhalation einen antiinflammatorischen Effekt auf die neutrophile Entzündungsreaktion in den CF Atemwegen hatte.

4.5 CD11b Expression auf neutrophilen Granulozyten Wir untersuchten die NG im IS hinsichtlich der Expression des Oberflächenmarkers CD11b.

Dabei ergaben sich folgende Befunde:

CD11b Expression auf Neutrophilen (MFI)

–  –  –

Die CD11b Expression auf NG nahm 2 und 4 Wochen nach Beginn der AAT Inhalation signifikant ab (p0.05 bzw. p0.01) (siehe Abbildung 5). Dies deutet darauf hin, dass die AAT Inhalationstherapie zu einer verminderten Aktivierung der NG in den CF Atemwegen führte und somit antiinflammatorisch wirkte.

4.6 Proinflammatorische Zytokine/ Lipidmediatoren Um zu überprüfen, ob die Änderungen der Proteasen/Antiproteasen-Balance und die Abnahme der NG nach AAT Inhalation mit einer Änderung proinflammatorischer Zytokine einhergehen, untersuchten wir die proinflammatorischen Zytokine IL-8, IL-1β, TNF-α und den proinflammatorischen Lipidmediator LTB4 in den IS Überständen der entsprechenden CF Patienten vor bzw. zwei und vier Wochen nach AAT Therapie.

Für TNF-α und LTB4 im IS ergaben sich folgende Befunde:

4.5 4.0 3.5

–  –  –

Abbildung 6: TNF-α und LTB4 im Sputumüberstand vor Behandlungsbeginn, sowie nach zwei und vier Wochen AAT Inhalation.

Die Proteinkonzentrationen von TNF-α (Abbildung 6 links), LTB4 (Abbildung 6 rechts), ILβ (Abbildung 7) und IL-8 (Abbildung 8) sanken zwei und vier Wochen nach Beginn der AAT Inhalation signifikant.

Für IL-1β im IS ergaben sich folgende Befunde:

17.5 15.0

–  –  –

Abbildung 7: IL- 1β im Sputumüberstand vor Behandlungsbeginn, sowie nach zwei und vier Wochen AAT Inhalation.

Für IL-8 im IS ergaben sich folgende Befunde:

Abbildung 9: Korrelation der freien Elastase mit den IL- 8 Spiegeln. (Weiße Kreise: vor AAT Therapie; Schwarze Kreise: nach AAT Therapie) Die NE Aktivität korrelierte positiv mit den IL-8 Spiegeln. Dies deutet darauf hin, dass die NE proinflammatorisch im Sinne der IL-8/NG Entzündungsreaktion wirkt. Die Markierung der Kreise zeigt, dass die AAT Therapie zu einer Abnahme der IL-8 Konzentrationen führte.





Bei der Korrelation der IL-8 Spiegel mit den prozentualen Anteilen der NG ergaben sich

folgende Befunde:

–  –  –

Abbildung 10: Korrelation der IL-8 Spiegel mit den prozentualen Anteilen der NG. (Weiße Kreise: vor AAT Therpaie; Schwarze Kreise: nach AAT Therapie) Die Prozentsätze der NG korrelierten positiv mit den IL-8 Spiegeln. Dies unterstreicht die zentrale Rolle von IL-8 als Chemokin, welches NG rekrutiert.

Bei der Korrelation der prozentualen Anteile der NG mit der NE ergaben sich folgende

Befunde:

–  –  –

Abbildung 11: Korrelation der prozentualen Anteile der NG mit der freien Elastase Die Prozentsätze der NG korrelierten positiv mit der NE Aktivität. Dies unterstreicht den Zusammenhang zwischen NG Akkumulation und NE Aktivität (mit NG als Quelle der NE).

5. Diskussion Ziel dieser Studie war es zu untersuchen, ob die Inhalation von AAT für 4 Wochen in CF Patienten die neutrophile Inflammationsreaktion in den Atemwegen reduzieren kann. Die Inhalation mit AAT führte zu einer Abnahme der Prozentsätze der NG und der proinflammatorischen Zytokine. Diese Befunde deuten darauf hin, dass AAT bei CF Patienten antiinflammatorisch wirken und so den Krankheitsverlauf günstig beeinflussen könnte.

5.1 Einfluss von DTT und Verarbeitungszeit Die präanalytische Vorbehandlung mit DTT ist für die Lösung des Mucus im IS unabdingbar.

Aufgrund seiner reduzierenden Eigenschaften könnte DTT die dreidimensionale Proteinstruktur der Oberflächenmarker, die über Disulfidbrücken aufrechterhalten wird, beeinflussen. Dies würde zu falschen durchflusszytometrischen Messungen führen. Wir fanden in unseren Proben keinen Einfluss von DTT auf die Expression der untersuchten NG Rezeptoren. Eine Studie hingegen fand für einige Marker eine veränderte Fluoreszenzintensität nach Behandlung mit DTT54. Allerdings wurden diese Proben aus dem PB gesunder Patienten gewonnen. Eine weitere Studie fand in DTT behandeltem IS eine höhere Gesamtzellzahl als in rein PBS behandeltem IS37. In unseren Ergebnissen fand sich zudem kein Hinweis für einen Einfluss der Verarbeitungszeit. Dies steht im Einklang mit den Ergebnissen einer Studie, die IS von 30 Asthmatikern untersuchte36. Sowohl für die sofortige Weiterverarbeitung innerhalb von 2 Stunden, als auch für eine verzögerte nach 9 bzw. 18 Stunden, ergaben sich keinerlei signifikanten Veränderungen der Gesamt- und Differentialzellzahl in dieser Studie. Die Ergebnisse einer weiteren Studie für innerhalb von 24, bzw. nach 48 bis 72 Stunden untersuchte IS Proben, ergaben ebenfalls keinerlei Auffälligkeiten bezüglich einer zeitlichen Beeinflussung der Weiterverarbeitung der Proben43.

Diese Daten deuten darauf hin, dass die Sputumanalyse mit Hilfe von DTT eine reliable Methode zur Analyse der hier untersuchten NG Rezeptoren darstellt.

5.2 Alpha-1-Antitrypsin und neutrophile Elastase Die NE ist verantwortlich für die Hydrolysierung von Bindegewebsproteinen der Lungenmatrix und damit der Entwicklung eines Lungenemphysems, sowie der progressiven Zerstörung der Lungenstruktur mit Bronchiektasen, wie sie bei CF Patienten beobachtet werden. Bei gesunden Patienten wird die Autodigestion der Lunge durch die lokale Antiproteasenaktivität, vornehmlich durch AAT, verhindert52. Mehrere Untersuchungen ergaben auffallend erhöhte aktive NE Werte im CF-Sputum40;66;86. Patienten mit chronischer Bronchitis wiesen ebenfalls NE im IS auf. Dies zeigt, dass freie proteolytische Aktivität, im Sinne einer Protease/Antiprotease-Dysbalance, kein CF spezifisches Phänomen darstellt, sondern generell im Rahmen chronisch entzündlicher Lungenerkrankungen auftreten kann.

Untersuchungen von CF Patienten ab 12 Jahren, die relativ symptomfrei waren und kein IS produzierten, wiesen in der BALF hohe Konzentrationen von aktiver NE auf47. In einer vorangegangenen Studie führte eine einwöchige AAT Inhalation- mit täglich zweimaliger Dosis zwischen 1,5 und 3,0 mg/kg - bei CF Patienten mit moderater respiratorischer Schädigung, zu einer vollständigen Inhibition der NE Aktivität in ELF bei einer AAT Konzentration von mindestens 8 μmol/l59. Hingegen nicht vollständig neutralisiert werden konnte die NE im IS durch AAT Inhalation in einer anderen Studie58. In einer weiteren Studie konnte gezeigt werden, dass unter Anwesenheit von AAT in vivo kein Effekt auf die IL-8 Freisetzung durch LPS nachweisbar war65. Weitere, Placebo-kontrollierte Studien zum Effekt der AAT Inhalation bei CF Patienten scheinen notwendig, da einige der in der aktuellen Studie beobachteten Effekte unspezifisch sein könnten.

5.3 Neutrophile Granulozyten Die NG spielen eine zentrale Rolle bei akuten nichtinfektiösen und bakteriellen Entzündungen, sowie der Phagozytose von opsonisierten Mikroorganismen, virusinfizierten Zellen, Tumorzellen und anderen körperfremden Antigenen. Das Hauptmerkmal des Entzündungsgeschehens bei CF ist ein ausgeprägter, persistierender Einstrom von NG in die Atemwege, vermittelt durch körpereigene und bakterielle Stoffe. Dies unterstreicht das Ergebnis einer Studie, die eine permanente, von NG dominierte Entzündung der Atemwege bei CF Patienten nachwies47. Dabei kennzeichnete auch Patienten mit mildem Krankheitsverlauf, ohne klinische Exazerbation, eine hohe Zahl an NG in den Atemwegen, was die frühzeitige Chronifizierung der Inflammation bei CF verdeutlicht. Studien bei Asthmatikern zeigten unter dem Einfluss von Endotoxin (LPS) und Ozon eine ausgeprägte Neutrophilenreaktion1;2. In einem Mausmodell wurde nach intranasaler LPS Gabe ebenfalls eine starke NG Einwanderung in die Atemwege beobachtet25. Unter den Vermittlern des chronischen NG Einstromes finden sich lösliche Bakterienprodukte, Fragmente der Komplementkaskade und zelluläre Produkte wie LTB4 und IL-833;45;46. Bei der Untersuchung der IS Proben unserer Patienten war eine positive Korrelation der IL-8 Spiegel und der prozentualen Anteile der NG festzustellen. Dies hebt die zentrale Rolle von IL-8 als Chemokin, das NG rekrutiert, hervor. Hohe IL-8 Spiegel und proinflammatorische Zytokine wie z.B. TNF-α, halten den Einstrom von NG in die Atemwege aufrecht und führen dort zu deren Anhäufung. So konnte in einer Studie durch die Hemmung der Aktivität von TNF-α und IL-8, in CF BALF eine erniedrigte NE Sekretion beobachtet werden87. Das lässt den Schluss zu, dass beide eine signifikante Rolle bezüglich der Expression und Aktivierung von NG und damit auch der Freisetzung von NE bei der CF spielen. In den von uns untersuchten IS Proben korrelierten die Zahl der NG positiv mit der Aktivität der NE. Daraus lässt sich ein direkter Zusammenhang zwischen der Akkumulation der NG und der Aktivität der NE ableiten. Die Zahl der NG spielt demnach eine Hauptrolle bei der Entstehung und Persistenz der neutrophilen Enzündungsreaktion bei CF und steht daher im Fokus einer antiiflammatorischen Strategie. Die Untersuchung unserer IS Proben zeigte vier Wochen nach Beginn der Inhalation mit AAT eine signifikante Abnahme der prozentualen Anteile der NG.



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