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«Direktor: Professor Dr. med. Dietrich Reinhardt Der Einfluss von Alpha-1-Antitrypsin Inhalation auf die neutrophile Entzündungsreaktion bei ...»

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3.1 Material 3.1.1 Patienten und Studiendesign Diese Studie wurde im Rahmen einer multizentrischen Studie mit den Studienzentren Frankfurt, Hannover, Giessen, Köln und München durchgeführt. Das Studien-Monitoring erfolgte durch Acromion GmbH (Frechen). Von allen Studienzentren wurden Ethikanträge bei den jeweiligen Ethikkommissionen beantragt und bewilligt. Von allen Patienten wurde vor Studienbeginn eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Einschlusskriterien für die Aufnahme in die Studie waren die gesicherte Diagnose von CF durch klinische Symptome, positiver Schweißtest und/oder Mutationen im CFTR Gen. Weitere Einschlusskriterien waren ein Mindestalter von 8 Jahren, eine Lungenfunktion von einem forcierten expiratorischen Volumen in einer Sekunde (FEV1) 25%, positive neutrophile Elastase Aktivität nachweisbar im IS vor Studienbeginn, positiver Test auf P.aeruginosa zu Studienbeginn, sowie die schriftliche Zustimmung seitens des Patienten. Ausschlusskriterien waren eine Lungentransplantation, schwerwiegende Begleiterkrankungen, schwere Leberzirrhose mit Aszites, aktive pulmonale Exazerbation, gewohnheitsmäßiger Zigarettenkonsum sowie Schwangerschaft. Es wurde isoliertes, monomeres humanes AAT (Prolastin, Bayer Corporation, Clayton, NA, USA) verwendet. Es wurde eine Konzentration verwendet, die einer Deposition von 25 mg/Tag entspricht. Initial wurde AAT mittels peripherer und bronchialer Depositionsmethode inhalativ verabreicht. Da jedoch in diesen Pilotstudien kein Unterschied zwischen beiden Depositionsmethoden gefunden wurde, entsprechen die in der vorliegenden Arbeit präsentierten Daten einem gepoolten Datensatz. Es wurden in der Studienpopulation keine unerwünschten Nebenwirkungen festgestellt.

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3.2 Methoden 3.2.1 Enzyme-linked Immunosorbent Assay Unter Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) versteht man die quantitative Messung eines bestimmten Proteins in einem Medium mittels enzymgekoppelter Antikörper (AK).

Zunächst wird ein Stoffgemisch mit einem AK inkubiert, der spezifisch das gesuchte Protein erkennt und an dieses bindet. Dieser primäre AK wird anschließend von einem sekundären erkannt und gebunden, welcher wiederum mit einem Enzym gekoppelt ist. Nach Zugabe einer Farbreagenz wird diese durch das indirekt an die gesuchte Substanz gekoppelte Enzym verändert. Die Intensität der Farbreaktion ist somit von der Konzentration der gesuchten Substanz im Stoffgemisch abhängig.

3.2.2 Nachweis und Messung der Zytokine Es wurde gemäß dem mitgelieferten Protokoll verfahren. Alle Arbeitsschritte wurden bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt. Eine Mikrotiterplatte mit einem gecoateten AK wurde benutzt und mit Standards oder den Proben für 2 Stunden bei RT inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde die Mikrotiterplatte für 2 Stunden mit einer zweiten AK-Lösung (Konjugatantikörper) inkubiert. Wieder wurde die Platte gewaschen und mit 100 μl eines Enzymkonjugats (Streptavidin konjugiert mit Peroxidase) pro Well für 20 Minuten (min) inkubiert. Schließlich wurde ein letztes Mal gewaschen, für 20 min mit 100 μl einer Substratlösung inkubiert und die Substratreaktion mit 50 μl einer H2SO4- haltigen Lösung gestoppt. Die Absorption wurde bei 450 nm mittels Photometer gemessen.

3.2.3 Sputuminduktion Vor der Sputuminduktion wurde eine Spirometrie durchgeführt, die Sauerstoffsättigung gemessen, auskultiert, und 2 Hub Sultanol verabreicht, um eine Bronchokonstriktion zu vermeiden. Danach wurde für die Dauer von 15 min mittels Pari LC Plus oder Pari LC Star, sowie einem Pari Master Kompressor mit 5 ml einer 5,85%igen NaCl-Lösung vernebelt. Der Speichel wurde in einen getrennten Behälter vor dem Hochhusten des IS verworfen. Das IS wurde nach 5, 10, 15 min (falls nötig auch zwischenzeitlich) in einem sterilen SputumContainer (auf Eis bei 4ºC) gesammelt. 5 min nach dem Ende der IS Kollektion erfolgten eine erneute Spirometrie, Messung der Sauerstoffsättigung und eine Auskultation. Das Volumen des gesamten expektorierten IS wurde durch das Hochziehen in einer 20 Milliliter (ml) Spritze gemessen.

3.2.4 Probenaufbereitung Die gewonnenen IS Proben wurden mit Dithiothreitol (DTT, Sputolysin) inkubiert, über Nitex Gaze filtriert und zentrifugiert, um die NG aus dem Schleim des IS zu lösen. IS Zellen wurden mikroskopisch mittels Zytospin und May-Grünwald-Färbung analysiert. Zur Zellgewinnung wurde das IS mit der gleichen Menge Sputolysin versetzt, gevortext, für 15 min in ein auf 37°C temperiertes Schüttelwasserbad gestellt und alle 5 min gemischt. Danach wurde das Suspensionsvolumen abgelesen, mit der gleichen Menge eines 1:1 Gemisches aus 0,9%iger NaCl-Lösung und Sputolysin versetzt, erneut für 10 min im Wasserbad geschüttelt und im Anschluss über Nitex Gaze gefiltert. Die so erhaltene Lösung wurde Sputumsuspension genannt. 10 µl dieser Sputumsuspension wurden in einer Neubauerkammer ausgezählt. Das Resultat dieser Zählung wurde mit 2,5 (Faktor Neubauerkammer) und 1000 multipliziert, um die Zellzahl/ml zu erhalten. Die Sputumsuspension wurde dann bei 4°C und 1600 U/min für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und erneut bei 3493 U/min und 4°C für 20 min zentrifugiert. Der so gewonnene Überstand wurde zur Aufbewahrung bei -80°C in Eppendorfgefäße mit und ohne Inhibitor abgefüllt. Das Zellpellet der ersten Zentrifugation wurde dann mit 10 ml Hankscher Lösung versetzt und erneut bei 1600 U/min und 4°C für 10 min zentrifugiert. Die Zellen dieser Zentrifugation wurden mit einem zu errechnenden Volumen an Hankscher Lösung aufgeschwemmt, um 200 000 Zellen pro Objektträger zu erhalten.





3.2.5 Sputumaufbereitung für die Durchflusszytometrie Die in Hankscher Lösung vorliegenden Zellsuspensionen wurden bei 1300 U/min 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet je nach Größe mit bis zu 1,5 ml PBS verdünnt und anschließend gevortext. Dann wurden je 50 µl der Suspension in 5 nummerierte Eppendorfgefäße pipettiert, mit Fc-Serum für 20 min inkubiert zur Blockierung unspezifischer Bindungen und danach mit vorbereiteten spezifischen monoklonalen AKMischungen versetzt und erneut gevortext. Nach 30 min Inkubationszeit bei 4°C wurden die so vorbereiteten Proben mit 1 ml PBS versetzt, resuspendiert und anschließend für 5 min bei 5000 U/min zentrifugiert. Der Überstand dieser Suspension wurde erneut verworfen, das Zellpellet mit 300 µl PBS resuspendiert und für die Durchflusszytometrie in die dafür vorgesehenen Glasröhrchen pipettiert, gevortext und anschließend im FACS Gerät analysiert.

Vor Beginn der Studie wurden das Gating der NG und die Abgrenzung zu Alveolarmakrophagen optimiert. Propidium iodide (5µg/ml) und Annexin V (5µg/ml, 1/100) wurden benutzt um apoptotische (Annexin V+ PI-) und nekrotische (Annexin V+ PI+) Zellen zu detektieren. Nur viable Zellen (Annexin V- PI-) wurden in die FACS Auswertung einbezogen.

3.2.6 Durchflusszytometrie Die Durchflusszytometrie wird mittels so genannter FACS Geräte durchgeführt. (FACS = Fluorescence activated cell sorter). Dabei führt man suspendierte Einzelzellen an einem Laser vorbei und kann anhand der mittels Detektoren nachgewiesenen charakteristischen Signale sowohl zelluläre Oberflächenproteine bestimmen, als auch extra- und intrazelluläre Antigene identifizieren, wenn fluoreszenzgefärbte AK verwendet wurden. Zur Durchführung einer solchen Bestimmung sind AK, Fluoreszenzfarbstoffe und ein Durchflusszytometer nötig.

Der Ablauf einer Zelluntersuchung anhand der Durchflusszytometrie besteht aus:

A. Färbung mittels Fluoreszenzfarbstoffen B. Messung C. Auswertung A. Fluoreszenzfärbung Bei der Fluoreszenzfärbung müssen die direkte und die indirekte unterschieden werden. Bei letzterer bindet ein fluoreszenzmarkierter zweiter AK an den ersten spezifischen AK, wohingegen bei ersterer die AK direkt mit Fluorochromen konjugiert werden. Mittels eines Argonlasers lassen sich die Fluorochrome anregen und deren Emissionsspektrum detektieren.

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Bei dem von uns verwendeten Durchflusszytometer handelt es sich um ein so genanntes 4Farben-Durchflusszytometer, mit dessen Hilfe die gleichzeitige Messung von bis zu 4 Fluorochromen in einer Probe möglich ist. Mit Hilfe von Titrationsreihen mit Vollblut wurde die optimale AK-Konzentration ermittelt, jede Probe mit vier verschiedenen AKKombinationen versetzt und im FACS Gerät analysiert (siehe Tab. mit AK-Kombinationen)

Färbeprotokoll für Sputumproben:

250 µl resupendiertes Zellpellet (Sputum) wurde zu je 50 µl auf fünf 1,5 ml EppendorfGefäße aufgeteilt.

Die AK wurden je nach Art und Anzahl den Reaktionsgefäßen zugefügt, gevortext und anschließend für 30 min bei 4°C inkubiert.

Dann wurden die Proben mit 1 ml PBS gewaschen und bei 5000 U/min für 5 min zentrifugiert und somit von freien AK gewaschen.

Abschließend wurde das Zellpellet mit 300 µl PBS resuspendiert und für die FACS Durchführung in Glasröhrchen pipettiert.

B. Messung Das FACS Gerät besteht aus 3 Einheiten.

Flüssigkeitssystem Optisches System Umwandlungssystem Flüssigkeitssystem Mit dem Einlegen der Probe in das FACS Gerät wird die Zellsuspension von einer Trägerflüssigkeit beschleunigt („Hydrodynamische Fokussierung“). Die Zellen werden dabei im Messpunkt fokussiert, passieren ihn einzeln und werden dabei vom Laser erfasst.

Optisches System Das Detektionssystem besteht aus dem Bereich zur Messung des Vorwärtsstreulichtes (FSC= Forward angle light scatter), dem Bereich zur Messung des Seitwärtsstreulichtes (SSC= Side angle light scatter) und der spezifischen Fluoreszenz für jedes einzelne Fluorochrom.

Abhängig von den unterschiedlichen physikalischen Zellparametern, wie Größe, Granularität und Membranstruktur, wird der Laserstrahl verschieden stark abgelenkt. Der FSCLichtstrahl, der die Zellen axial trifft, korreliert mit der Zellgröße, während der orthogonal die Zellen treffende SSC- Lichtstrahl mit der Granularität und äußeren Zellform korreliert.

Umwandlungssystem Die so entstehenden optischen Signale können mit Hilfe äußerst empfindlicher Photodetektoren und Photodioden in elektrische Signale umgewandelt werden. Mittels Software können diese graphisch dargestellt und ausgewertet werden.

C. Auswertung Die Datenauswertung erfolgte mit dem Programm Cell Quest 3.1f von Becton & Dickinson (siehe unter Material).

3.2.7 Oberflächenmarker NG in IS wurden anhand der Laser-Streuungseigenschaften (FSC/SCC) und der NG Oberflächenmarker CD45 (Pan-Leukozytenmarker) und CD16 (Granulozytenmarker, FcγRIII) identifiziert. Die Expression von CD11b (MFI) wurde auf NG durchflusszytometrisch charakterisiert. Es wurden spezifische Isotypkontrollen verwendet, um unspezifische Fc-Bindungen auszuschließen. Ebenso wurden die Stabilität der CD11b Expression über 12 und 24 Stunden, sowie der Einfluss von DTT auf die Oberflächenmarkerexpression untersucht.

3.2.8 Statistik Für den Vergleich der Werte vor, gegen und nach der AAT Therapie, wurde der nichtparametrische Wilcoxon-Test mit Bonferroni Korrektur für multiple Vergleiche angewandt.

4. Ergebnisse

4.1 Patientengruppen Zu Studienbeginn wurden 72 CF Patienten in die Untersuchung aufgenommen. Nach Ausschluss von 20 Patienten wegen Protokollverletzung bzw. Non-Compliance umfasste die Gruppe der untersuchten Patienten letztendlich 52 Patienten.

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Tabelle 2: Patientengruppen mit peripherer und bronchialer Deposition Dargestellt sind Mittelwerte Standardabweichungen vom Mittelwert



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