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«Epstein-Barr-Virus positive Lymphoproliferationen und Non-Hodgkin-Lymphome der B-Zellreihe: Eine immunhistochemische und zytogenetische Studie. ...»

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Aus dem Institut für Pathologie

der Universität Würzburg

Vorstand: Prof. Dr. med. H. K. Müller-Hermelink

Epstein-Barr-Virus positive Lymphoproliferationen und Non-Hodgkin-Lymphome

der B-Zellreihe:

Eine immunhistochemische und zytogenetische Studie.

Inauguraldissertation

zur Erlangung der Doktorwürde der

Medizinischen Fakultät

der

Bayrischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von

Heike Naser

aus Fürth

Würzburg, September 2007 Referent: Prof. Dr. med. German Ott Korreferent: Prof. Dr. med. Holger Höhn Dekan: Prof. Dr. med. Matthias Frosch Tag der mündlichen Prüfung: 15.01.2008 Die Promovendin ist Zahnärztin.

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

1.1 Das Epstein-Barr-Virus (EBV)

1.2 Der Lebenszyklus des Epstein-Barr-Virus

1.3 Die virale Proteinexpression infizierter B-Zellen

1.4 Das Epstein-Barr-Virus: Infektiöse Mononukleose und maligne Tumoren.........4 1.4.1 Nasopharynxkarzinom

1.5 Maligne Lymphome

1.5.1 Diffuse großzellige B-Zell-Lymphome (DLBCL)

1.6 Lymphome und Lymphoproliferationen bei Immundefizienz

1.7 Posttransplantations-assoziierte lymphoproliferative Erkrankungen (PTLD)......8

1.8 Andere EBV-assoziierte Lymphoproliferationen/Lymphome

1.9 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit

2. Material und Methoden

2.1 Material

2.2 Einteilung des Untersuchungsmaterials

2.3 Histopathologische Klassifikation

2.4 Erstellung der Gewebearrays ( tissue microarray )

2.5 Immunhistochemie

2.5.1 Auswertung der Immunhistochemie

2.5.2 Erfassung der Immunhistochemie hinsichtlich des GCB-und non-GCB-Status 16

2.6 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)

2.6.1 Auswertung der FISH-Präparate

2.7 Klonalitätsanalysen

2.8 Statistik

3. Ergebnisse

3.1.1 Übersicht über die ausgewerteten Fälle

3.2.1 Morphologische Diagnosen

3.2.2 Einteilung nach klinischer Grunderkrankung

3.2.3 Korrelation der Grundkrankheiten mit den morphologischen Diagnosen.......... 23

3.3 Immunhistochemische Charakterisierung

3.3.1 EBV-Assoziation und Verteilung der Latenztypen

3.3.2 Expression von CD10, BCL-6 und MUM1

3.3.3 Korrelation der CD138-Reaktivität mit den Daten des Hans-Klassifikators...... 28 3.3.4 Sekretorische Differenzierung

3.3.5 Korrelation der sekretorischen Diffferenzierung mit der Einstufung nach dem Hans-Klassifikator und der CD138-Expression

3.3.6 Antiapoptosemarker, Aktivierungsmarker und Proliferationsmarker................. 30

3.4 Humanes Herpesvirus 8 (HHV8)

3.5 Untersuchungen zur Klonalität

3.6 Nachweis chromosomaler Aberrationen in der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)

3.7 Daten zu einer nicht-EBV-assoziierten Kontrollgruppe

3.7.1 Immunhistochemie der Kontrollgruppe

3.7.2 Hans-Klassifikator

3.7.3 Weitere immunhistochemische Marker der Kontrollgruppe

3.7.4 Zytogenetische Daten der Kontrollgruppe

3.8 Korrelation der Morphologien untereinander und der Grunderkrankungen untereinander

3.8.1 Vergleich der immunhistochemischen Korrelationen bei DLBCL, Nicht-DLBCL und zur Kontrollgruppe

3.8.2 Vergleich der zytogenetischen Korrelationen bei DLBCL, Nicht-DLBCL und zur Kontrollgruppe

3.8.3 Vergleich der Nicht-DLBCL mit der Kontrollgruppe

3.8.4 Vergleich der Grunderkrankungen untereinander

4. Diskussion

4.1 Patientenkollektiv, EBV-Assoziation und klinische Daten

4.2 Senile EBV-assoziierte Lymphoproliferationen

4.3 GCB- und non-GCB-Status

4.4 Expression von CD138, BCL-2 und BCL-6

4.5 Interphasenzytogenetische Untersuchungen

4.6 Humanes Herpesvirus 8

5. Zusammenfassung

6. Literatur

1. Einleitung

1.1 Das Epstein-Barr Virus (EBV) Das Epstein-Barr Virus (humanes Herpesvirus 4 - HHV4 bzw. EBV) ist ein behülltes DNA-Virus der Familie Herpesviridae. Es besteht aus einer linearen DoppelstrangDNA (184 kbp) mit einem ikosaedrischen Nukleokapsid und ist 150-250 nm groß. Es zählt zur Subfamilie der Gammaherpesvirinae, Gattung Lymphokryptovirus (1). Es wurde 1964 von Epstein und Barr bei elektronenmikroskopischen Untersuchungen von humanen B-Zelllinien, die aus afrikanischen Burkitt-Lymphomen isoliert worden waren, entdeckt (2). Der einzige Wirt des EBV ist der Mensch. Infiziert werden Epithelien und B-Lymphozyten.

Das Virus bindet mit einem Glycoprotein (gp 350) seiner Hülle an den CD 21-Rezeptor, der sich auf der Oberfläche von humanen B-Lymphozyten befindet. Ergänzend bindet es noch mit Hilfe eines zweiten Glycoproteins (gp 42) an den HLA-II-Rezeptor der Lymphozyten (3). In der infizierten Zelle liegt das virale Genom meist episomal vor (4).

1.2 Der Lebenszyklus des Epstein-Barr Virus Das EBV wird von Wirt zu Wirt durch den Speichel übertragen. Man unterscheidet eine akute Phase (mit lytischer Replikation und ggf. Zerstörung der Wirtszelle) und eine Latenzphase, die lebenslang andauert. Primäre Infektionen haben ihren Ursprung wahrscheinlich im Epithel des Oropharynx, wo das Virus während der akuten Infektion in erster Linie repliziert (5,6). Der Speichel des infizierten Wirtes ist meist nur während der Primärinfektion infektiös, das Virus kann aber auch 3 bis 4 Jahre von infizierten Zellen des Oropharynx in den Speichel abgegeben werden (7). Nachfolgend infiziert es dort „vorbeiwandernde“ B-Lymphozyten (B-lymphotrop). Das EBV persistiert lebenslang latent in zirkulierenden ruhenden B-Gedächtniszellen (8, 9).





Das Virus hat in vitro die Fähigkeit zur Immortalisierung ruhender B-Lymphozyten, die zu kontinuierlich wachsenden lymphoblastoiden Zelllinien transformiert werden (10), da in vitro die CD8+-Immunantwort des infizierten Wirtes fehlt.

EBV-infizierte B-Zellen können prinzipiell jederzeit von der Latenzphase in den lytischen Zyklus übertreten. Dabei werden in der Wirtzelle Proteine exprimiert, die diese zur Proliferation anregen. Im gesunden, immunkompetenten Wirt löst die infizierte B-Zelle (über LMP1) eine Immunantwort von zytotoxischen CD8+ T-Zellen aus, welche die infizierten B-Zellen zerstören und damit die Erkrankung limitieren. Das EBV persistiert in ruhenden, zirkulierenden B-Gedächtniszellen mit einer Häufigkeit von 1:1000000 Zellen lebenslang (nur EBNA-1 wird exprimiert, welches keinen Angriffspunkt für die CD8+Zellen bietet) (4).

1.3 Die virale Proteinexpression infizierter B-Zellen Die viralen Proteine des Epstein-Barr Virus interagieren mit veschiedenen antiapoptotischen Molekülen, um die Infektion zu verbreiten, Zellen zu immortalisieren oder zu transformieren (4,8,11,12). Im folgenden werden nur die Proteine der Latenz besprochen. Es handelt sich hierbei um EBV-encoded nuclear antigens (EBNAs), latente Membranproteine (LMPs) und EBV encoded RNAs (EBERs) (8,13-17).

Tabelle 1: Übersicht über die jeweiligen Proteine und ihre Funktion Virales Protein Funktion

–  –  –

Um onkogen zu wirken, muss das EBV sein virales Genom in der Wirtszelle erhalten, es vermeiden, die Zelle zu zerstören und seine Wirtszelle darf nicht vom Immunsystem als Schädling erkannt und eliminiert werden. Das Epstein-Barr Virus bildet in der Latenzphase aus seinem Genom ein ringförmiges Episom, das in vielen Kopien in der Zelle vorliegt oder integriert sein Genom in das Wirtsgenom. Normalerweise reagieren zytotoxische CD 8+ Zellen auf latente Membranproteine und eliminieren die befallene B-Zelle. In ruhenden B-Zellen ist nur EBNA 1 exprimiert, welches nicht immunogen wirkt, so dass diese Zellen nicht vom Immunsystem mittels der CD8+ Zellen eliminiert

werden können. Man unterscheidet 3 verschiedene Latenzstadien bzw. -typen (4):

Tabelle 2 : Latenztypen des EBV Latenztyp exprimierte virale Proteine

–  –  –

1.4 Das Epstein-Barr Virus: Infektiöse Mononukleose und maligne Tumoren Das Epstein-Barr Virus ist weltweit verbreitet und über 95% der Weltbevölkerung sind mit ihm infiziert. Es verursacht als Primärinfektion die infektiöse Mononuklose (IM), das Pfeiffer’sche Drüsenfieber. Vor dem 10. Lebensjahr verläuft die Infektion in der Regel asymptomatisch (18). Die infektiöse Mononukleose ist eine gutartige, selbstlimitierende lymphoproliferative Erkrankung, die nur sehr selten tödlich verläuft (1 von 3000 Fällen) (18).

Das Virus ist mit verschiedenen Tumoren assoziiert, wie dem Nasopharynxkarzinom, malignen Lymphomen, Leiomyosarkomen bei Immunsuppression und bestimmten Typen von Adenokarzinomen.

1.4.1 Nasopharynxkarzinom Das Nasopharynxkarzinom ist ein in der westlichen Hemisphäre eher seltener Tumor, der mit gehäufter Prävalenz in der Provinz Canton in China, in Hongkong, Taiwan und bei den Inuit (Eskimos) in Alaska und Grönland auftritt (19-22). In Taiwan ist es der häufigste Tumor bei Männern und der dritthäufigste Tumor bei Frauen. Gründe dafür mögen bestimmte HLA-Antigenprofile sein und/oder verschiedene Umweltfaktoren (salziger Fisch, Umweltgifte, Nikotin) (23-27). Beim Nasopharynxkarzinom infiziert das Epstein-Barr Virus die Epithelzellen in der Rosenmüller-Grube des Waldeyer’schen Rachenrings im hinteren Nasopharynx (28).

Es existieren 2 Modelle, um die Infektion dieser Epithelzellen mit dem Virus zu erklären: Zum einen wurde ein Oberflächenprotein beschrieben, das dem CD21Rezeptor der B-Zellen ähnlich ist und eventuell als Eintrittspforte benutzt werden könnte (4, 29). Alternativ könnte das Virus durch IgA-mediierte Endozytose in die Epithelzellen des Nasopharynx gelangen (30). Die EBV-Genome, die man in den infizierten Epithelzellen fand, waren klonalen Ursprungs, auch sind die Zellen des umliegenden Gewebes, sowie einwandernde T-Zellen nicht infiziert (31, 32). Das EBV wurde in in-situ Nasopharynxkarzinomen nachgewiesen (33). Dies alles deutet darauf hin, dass die EBV-Infektion vor der Entstehung der Neoplasie aufgetreten ist und notwendig für das Fortschreiten des malignen Erscheinungsbildes war.

1.5 Maligne Lymphome Maligne Lymphome sind Neoplasien, die von Lymphozyten bzw. deren Vorläuferzellen abstammen. Sie treten häufig als nodale Lymphome in Lymphknoten, aber auch extranodal in der Milz, den Tonsillen oder in extralymphatischem Gewebe wie z.B. im Magen, ZNS, Darm oder Knochenmark auf.

Die Einteilung erfolgt nach der WHO (World Health Organization)-Klassifikation maligner Lymphome von 2001 (34). Man unterscheidet B-Zell-Lymphome, T-ZellLymphome, Hodgkin-Lymphome, und lymphoproliferative Erkrankungen bei Immundefizienz. Entscheidend für die Zuordnung zur einzelnen Entität ist die postulierte Zelle, aus der die Neoplasie entstanden ist.

Non-Hodgkin Lymphome (NHL) der B-Zell Reihe umfassen im Westen etwa 85% aller Non-Hodgkin-Lymphome. Die häufigsten Typen sind das diffuse, großzellige B-ZellLymphom (DLBCL) und das follikuläre Lymphom (FL). Sie machen zusammen etwa 50% aller Non-Hodgkin-Lymphome aus (34). Reife B-Zell-Neoplasien rekapitulieren verschiedene Stadien der normalen B-Zell Differenzierung, und können über ihre Morphologie und ihren Immunphänotyp der postulierten Ursprungszelle zugeordnet werden. Einige von Ihnen weisen auch spezifische zytogenetische Aberrationen auf, die häufig mittels einer Translokation ein zelluläres Proto-Onkogen unter den Einfluss des Immunglobulin-Promoters bringen (z.B. wird beim Burkitt-Lymhom eine t(8;14)(q24;q32) beobachtet, die das MYC Gen in Chromosom 8 unter den Einfluss des Schwerkettengen-Promotors in der Bande q32 in Chromosom 14 bringt (35)). Die exakte Unterteilung der Lymphome in biologisch relevante Subtypen hat die Therapie teilweise schon sehr verbessern können (z.B. die Eradikation von Heliobacter pylori beim MALT-Lymphom (36-38) oder der Einsatz von CD20-Antikörpern bei CD20 positiven Lymphomen (34).

Die folgende Tabelle gibt eine Übersicht über die B-Zell Neoplasien der derzeit gültigen

WHO-Klassifikation:

Tabelle 3: Die WHO-Klassifikation maligner B-Zell-Lymphome (34):

B-Zellneoplasien Vorläufer B-Zell Neoplasien

- Akute B-lymphoblastische Leukämie/Lymphom (B-ALL) Reife B-Zell Neoplasien

- Chronische lymphatische Leukämie/kleinzelliges B-Zell-Lymphom (CLL)

- Prolymphozytenleukämie vom B-Zell-Typ

- Lymphoplasmozytisches Lymphom

- Mantelzell-Lymphom



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